藏藥紅景天苷對(duì)斑馬魚發(fā)育及急性毒性的評(píng)價(jià)

樊紅艷 何樹梅 楊建偉 劉紅旭

【摘 要】 目的：評(píng)價(jià)藏藥紅景天苷（Salidroside，SAL）對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育及幼魚的急性毒性作用，為紅景天苷在斑馬魚模型中的研究空白提供理論依據(jù)，同時(shí)也為后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。方法：在顯微鏡下挑選6 h（6 hour-post-fertilization，6hpf）及受精后4d（4 days-post-fertilization，4dpf）的斑馬魚胚胎和幼魚，分別暴露在0.8、1.6、3.2、6.4、12.8不同濃度梯度的紅景天苷溶液及空白對(duì)照（養(yǎng)殖水）中，觀察暴露12、24、48、72 h胚胎發(fā)育及幼魚的畸形及死亡情況。結(jié)果：斑馬魚胚胎及幼魚暴露于紅景天苷不同濃度組（0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM）均無(wú)明顯的致畸、致死作用。結(jié)論：藏藥紅景天苷在受試劑量下對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚無(wú)明顯的急性毒性及致畸作用。

【關(guān)鍵詞】

紅景天苷;斑馬魚;致畸作用;急性毒性

【中圖分類號(hào)】R994.39?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）19-0018-04

Evaluation on the Development and Acute Toxicity of Rhodioside to Zebrafish

FAN Hongyan HE Shumei* YANG Jianwei LIU Hongxu

Key Laboratory of Life Sciences University of Xizang Nationalities University Medical Department，Xianyang 712082， China

Abstract：

Objective To evaluate the acute toxicity of Salidroside（SAL） in zebrafish embryos and larvae.Methods Normally developed 6hpf（6 hour-post-fertilisation， 6hpf）zebrafish embryos and 4dpf （4 days-post-fertilisation 4dpf） larvae selected under microscop，then exposed to 5 different concentrations of Salidroside solutions，control group（cultivation water） respectively.The teratogenicity rate of embryo，mortality rate of enmryos and larvae，were calculated on 12， 24， 48， and 72 h respectively.Results Salidroside does not show significant teratogenic and lethal effect in zebrafish embryos and larvae are exposed at the does levels of 0.8，1.6，3.2，6.4，12.8 mM.Conclusion Salidroside has no acute toxicity and teratogenic effect on zebrafish embryo and larvae under the experimental dose.

Key words：

Salidroside; Zebrafish; Teratogenic Effect; Acute Toxicity

藏藥是民族醫(yī)藥的代表之一，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中發(fā)揮著重要作用。藏藥紅景天是景天科多年生草本植物，又名“掃羅瑪布爾（藏語(yǔ)）”“薔薇紅景天”等，被人們稱為“高原人參”[1]。紅景天苷（Salidroside，SAL）是由紅景天中提取的一種主要有效成分[1]。近年來(lái)，紅景天苷在是一種開發(fā)前景較好的藥物，在臨床上得到日益廣泛的應(yīng)用。在抗衰老方面，紅景天苷通過(guò)激活A(yù)MPK磷酸化，抑制NF-κBp65和NLRP3炎性小體的活化來(lái)改善內(nèi)皮炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。據(jù)報(bào)道[3]：紅景天苷中分離出的一種成分與白藜蘆醇具有相當(dāng)?shù)目顾ダ闲Ч?，通過(guò)miR22/SIRT1途徑增加線粒體的生物合成，從而延緩衰達(dá)到抗衰老的功效。在抗腫瘤方面，紅景天苷一方面通過(guò)抑制相關(guān)信號(hào)通路的激活降低腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4-6];另一方面通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和T、B淋巴細(xì)胞的免疫功能來(lái)預(yù)防腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。在抗炎癥方面，紅景天苷在各種病理狀態(tài)下均具有抗炎活性，較其他抗炎制劑安全性更高、副作用更小[8]。其他方面，紅景天苷還能夠促進(jìn)大鼠脊髓損傷的功能恢復(fù)[9]，通過(guò)AKT /GSK3β信號(hào)傳導(dǎo)抑制血小板功能和血栓形成，在治療血栓或心血管疾病方面具有重要的作用[10]等。紅景天苷對(duì)不同疾病的治療及預(yù)后起到了積極的保護(hù)作用，因而具有重要的研究?jī)r(jià)值。

新興的模式生物斑馬魚以其胚胎透明、發(fā)育迅速、體積小、成本較低等優(yōu)勢(shì)已被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)和人類疾病的研究中[11]。斑馬魚的胚胎具有藥物滲透性，可應(yīng)用于藥物研究及毒性的研究[12]，為評(píng)價(jià)藥物毒性提供了理想的工具。本研究采用受精后6h（6 hours-post-fertilization，6hpf）斑馬魚胚胎及受精后4d（4 days-post-fertilization，4dpf）幼魚來(lái)評(píng)價(jià)紅景天苷急性毒性效應(yīng)及對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸作用，為確定紅景天苷對(duì)斑馬魚疾病模型的安全劑量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型AB斑馬魚由上海市公共衛(wèi)生臨床中心斑馬魚實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)提供。循環(huán)養(yǎng)殖水根據(jù)實(shí)驗(yàn)室斑馬魚使用指南[13-14]中的方法配置。水溫控制在（28±0.5）℃，PH值7.0～7.2，電導(dǎo)率450～550 μS/cm，光亮/黑暗周期為14 h/10 h。成年斑馬魚每日喂食3次（人工孵育豐年蝦2次，輔助飼料1次）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 紅景天苷購(gòu)置于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 斑馬魚飼養(yǎng)系統(tǒng)（上海鱗道）;變倍體視顯微鏡（日本奧林巴斯）;生化培養(yǎng)箱（濟(jì)南創(chuàng)日新）;六孔板;移液槍;塑料吸管;50ml離心管;培養(yǎng)皿;交配缸。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚的配種及胚胎的收集 實(shí)驗(yàn)前一晚8點(diǎn)將野生型雌雄斑馬魚按照1∶1或1∶2配對(duì)，放入裝有隔板的交配缸中，第二天早上8點(diǎn)給予光照，抽離隔板，雄魚開始追逐雌魚并在30 min內(nèi)完成交配產(chǎn)卵。產(chǎn)卵完成后，用養(yǎng)殖水輕柔沖洗數(shù)次除去未受精卵、糞便等殘留物后收集于盛有養(yǎng)殖水的培養(yǎng)皿中，置于28.5 ℃溫箱中培養(yǎng)待用。

1.2.2 給藥方法 給藥方式為浸泡法，具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[15]所述以及Patricia McGrath的斑馬魚評(píng)價(jià)藥物安全和毒性方法[16-17]進(jìn)行。

1.2.3 紅景天苷樣品溶液的配置 本實(shí)驗(yàn)使用胚胎培養(yǎng)液將母液稀釋至0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM五個(gè)濃度梯度。

1.2.4紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎致畸試驗(yàn)方法 在顯微鏡下挑選受精后6 h（6 hour-post-fertilization，6hpf）且發(fā)育狀態(tài)良好的胚胎，并將其隨機(jī)轉(zhuǎn)入含有不同濃度紅景天苷溶液的6孔板，每板設(shè)置5個(gè)（0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM）藥物濃度，同時(shí)以養(yǎng)殖水作為空白組，每孔40枚胚胎。置于28.5 ℃溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定，分別于給藥后12、24、48、72 h觀察并記錄胚胎的形態(tài)學(xué)變化。其中，畸形的種類主要有卵黃囊腫大、尾部彎曲、魚鰭缺失、心包腫脹。取不同親本的胚胎重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.2.5 紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)方法 在顯微鏡下挑選受精后6 h（6 hour-post-fertilization，6hpf）且發(fā)育正常的胚胎，并將其隨機(jī)轉(zhuǎn)入含有不同濃度紅景天苷溶液的6孔板，每板設(shè)置5個(gè)（0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM）藥物濃度，同時(shí)以養(yǎng)殖水作為空白組，每孔40枚胚胎。置于28.5 ℃溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定，分別于給藥后12、24、48、72h觀察并記錄胚胎的死亡變化。取不同親本的胚胎重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.2.6 紅景天苷對(duì)斑馬魚幼魚毒性實(shí)驗(yàn)方法 在顯微鏡下挑選受精后4 d（4 days-post-fertilization，4dpf）且發(fā)育正常的胚胎，并將其隨機(jī)轉(zhuǎn)入含有不同濃度紅景天苷溶液（0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM）的培養(yǎng)皿，同時(shí)以養(yǎng)殖水作為空白組，每皿20尾于28.5 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定，分別于給藥后24、48、72 h觀察并統(tǒng)計(jì)幼魚的死亡率。取不同親本的幼魚重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用統(tǒng)t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的評(píng)價(jià) 在顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)不同濃度的紅景天苷溶液中與空白對(duì)照組相比，畸形數(shù)均≤2，均沒有出現(xiàn)心包水腫、脊柱彎曲、尾部彎曲及溶解畸形等現(xiàn)象?？瞻讓?duì)照組與不同濃度的紅景天苷組畸形率比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），表明在受試劑量下，紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育無(wú)明顯的致畸作用（圖1）。

2.2 紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎急性毒性的評(píng)價(jià) 在顯微鏡下分別觀察12、24、48、72 h斑馬魚胚胎在不同時(shí)間點(diǎn)各組的死亡數(shù)，不同濃度的紅景天苷組與空白對(duì)照組相比，死亡數(shù)均≤2，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），表明在受試劑量下，紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎相對(duì)安全，無(wú)明顯的急性毒性作用。如圖2所示。

2.3 紅景天苷對(duì)斑馬魚幼魚急性毒性的評(píng)價(jià) 將4dpf（4 days-post-fer fertilization，4dpf）的斑馬魚幼魚分別暴露在不同濃度的紅景天苷溶液中，分別在給藥后24、48、72 h觀察幼魚的死亡情況。與空白對(duì)照組相比，不同濃度的紅景天苷組幼魚的死亡數(shù)均≤2，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），不同濃度的紅景天苷對(duì)斑馬魚幼魚無(wú)明顯的急性毒性作用。如圖3所示。

3 討論

本研究以理想的模式生物斑馬魚為模型，采用浸泡給藥的方式來(lái)評(píng)價(jià)紅景天苷對(duì)于斑馬魚胚胎的發(fā)育及幼魚的急性毒性作用。結(jié)果表明，在濃度為0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM的紅景天苷溶液對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育無(wú)致畸作用，對(duì)其胚胎和幼魚無(wú)明顯的急性毒性作用，這一結(jié)果與大鼠模型中的結(jié)果相似[18]，是否更高的劑量濃度能夠?qū)Π唏R魚胚胎的發(fā)育及幼魚產(chǎn)生致畸作用及毒性作用暫不明確。

紅景天苷作為一種重要的藏藥，具有較高的藥用價(jià)值，而利用斑馬魚模型來(lái)評(píng)價(jià)紅景天苷的毒性試驗(yàn)尚未報(bào)道。希望可以通過(guò)斑馬魚模型來(lái)完善對(duì)紅景天苷毒性的認(rèn)知，以期為紅景天苷在斑馬魚疾病模型的安全用量提供理論依據(jù)，同時(shí)也能夠?yàn)槲覀兒罄m(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-02-23 編輯：劉斌）