籽用美洲南瓜葉片對白粉病菌的抗逆生理響應(yīng)

許 珂，王 萍，崔曉偉，張 穎

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特 010011)

籽用美洲南瓜俗稱籽用西葫蘆(CucurbitapepoL.)，為葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(CucurbitaL.)草本植物。白粉病為籽用美洲南瓜生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的病害之一，表現(xiàn)為分布廣，危害時(shí)間長，整個(gè)生育期均可發(fā)病，傳播速度較快，主要侵染葉片，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)蔓延至莖蔓，嚴(yán)重影響籽用美洲南瓜產(chǎn)量[1]。研究表明在內(nèi)蒙古地區(qū)白粉病菌為單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii)，存在4個(gè)生理小種,分別為小種4、2F和1,還有1個(gè)未知的小種[2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病原菌侵染植物時(shí)，葉片中活性氧會迸發(fā)，這被認(rèn)為是植物對病原菌響應(yīng)的早期防御反應(yīng)之一[3]。植物與病原菌的互作可以產(chǎn)生過敏反應(yīng)，寄主細(xì)胞受到病原菌侵染后會迅速凋亡來延緩病原菌的進(jìn)一步生長[4]。李建武[5]發(fā)現(xiàn)，黃瓜與霜霉病的互作中產(chǎn)生大量活性氧，限制了病害的發(fā)生。同時(shí)活性氧可以作為信號分子存在，誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)和植物對環(huán)境的適應(yīng)反應(yīng)[6]。同時(shí)，植物體內(nèi)存在活性氧清除系統(tǒng)，可以在一定范圍內(nèi)維持活性氧的平衡。植物被病原菌侵染后，寄主體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)等防御酶活性發(fā)生顯著變化，并認(rèn)為這些酶與抗病性相關(guān)[7-9]。田麗波等[10]發(fā)現(xiàn)苦瓜葉片的葉綠素、POD和PPO活性與白粉病的病情指數(shù)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，均可作為苦瓜對白粉病抗性早期鑒定的指標(biāo)。刁倩楠等[11]報(bào)道，不同甜瓜品種接種白粉病后，其抗氧化酶活性均呈先升高后降低的變化趨勢，且整體升高幅度表現(xiàn)為抗病品種大于感病品種。

目前，對籽用美洲南瓜白粉病的研究主要集中在技術(shù)防治及抗病基因的篩選方面，而對美洲南瓜與白粉病的互作所產(chǎn)生的生理變化和活性氧的積累與材料抗病性之間聯(lián)系的研究相對較少。故本研究選取前期篩選出的籽用美洲南瓜白粉病抗病品系及感病品系，對其接種后不同時(shí)間的葉片進(jìn)行組織化學(xué)染色，觀察活性氧積累以及抗氧化酶和相關(guān)物質(zhì)含量的動態(tài)變化，探究其對白粉病菌的生理響應(yīng)機(jī)制，為籽用美洲南瓜白粉病防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)選用高代自交的籽用美洲南瓜感病品系M3和抗病品系F2為植物材料。白粉病菌(Podosphaeraxanthii)收集于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)籽用美洲南瓜種植基地田間自然發(fā)病籽用美洲南瓜葉片上的白粉病菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期鑒定其生理小種為2US。

1.2 方 法

1.2.1 籽用美洲南瓜白粉病菌的擴(kuò)繁收集田間自然發(fā)病籽用美洲南瓜葉片上的白粉病菌,將其溶于2%的Tween-20中,制成濃度為1×106·mL-1的孢子懸浮液,噴施于籽用美洲南瓜健康植株葉片上，置于溫度25～30 ℃、濕度75%～85%的拱棚中，經(jīng)5次擴(kuò)繁后噴施于籽用美洲南瓜植株葉片上，活體保存,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 籽用美洲南瓜與病原菌互作觀察植株長至2葉1心時(shí)進(jìn)行接菌，接菌后分別在 0、12、24、36、48、72、96和120 h采取葉片，利用臺盼藍(lán)染色法[12]對采集的植株幼葉樣品進(jìn)行處理，在COIC BK3200光照顯微鏡10×40倍或10×20倍下觀察植物與病原菌的互作情況。

1.2.3 葉片組織化學(xué)染色分別在接種后1、3、5、7、10和15 d采集第一片真葉，用于組織化學(xué)染色觀察，進(jìn)行3次重復(fù)。用NBT染色[13]法檢測超氧陰離子、DAB染色[13]檢測H2O2的累積量。

1.2.4 抗氧化酶活性及其相關(guān)生理指標(biāo)測定兩葉一心時(shí)接種白粉病，取田間自然發(fā)病的葉片，經(jīng)3次純化后，采用孢子懸浮液進(jìn)行接種，以噴施清水作為對照，置于人工氣候箱中正常管理。分別在接種后1、3、5、7、10和15 d，隨機(jī)取第一片真葉測定相關(guān)生理生化指標(biāo)，3次重復(fù), 取平均值。CAT、SOD、POD、PAL、PPO活性以及MDA、葉綠素含量的測定均參照李合生[14]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽用美洲南瓜與白粉病病原菌的互作效應(yīng)

籽用美洲南瓜感病品系M3和抗病品系F2在接種白粉病病原菌不同時(shí)間后的顯微鏡觀察結(jié)果(圖1)顯示，感病品系M3在接種12 h時(shí)葉片中白粉病病原菌孢子萌發(fā)出芽管(圖1，b)，接種24 h后芽管開始生長，形成短小菌絲(圖1，c)，直至接種36 h白粉病病原菌生長處于菌絲生長階段(圖1，d)，接種48 h時(shí)白粉病菌絲生長出次生菌絲并持續(xù)增長(圖1，e)，接種72～96 h時(shí)分生孢子梗開始萌發(fā)并持續(xù)生長形成網(wǎng)狀菌絲體(圖1，f、g)，接種120 h時(shí)分生孢子生長密集(圖1，h)；而抗病品系F2在接種 0～24 h期間葉片中白粉病病原菌沒有變化(圖1，i-k)，在接種36 h時(shí)芽管開始萌發(fā)(圖1，l)，接種48 h時(shí)芽管開始生長(圖1，m)，接種72 h時(shí)芽管生長成短小菌絲(圖1，n)，接種96 h時(shí)菌絲持續(xù)增長(圖1，o)，接種120 h時(shí)次生菌絲產(chǎn)生(圖1，p)。以上結(jié)果說明病原菌在感病品系葉片上發(fā)育較快，更容易侵染葉片。

2.2 白粉病菌侵染對籽用美洲南瓜葉片形態(tài)及葉綠素含量的影響

由圖2可以看出，白粉病菌侵染1 d時(shí)，抗病和感病籽用美洲南瓜品系葉片均沒有任何差別；接種侵染3 d時(shí)，感病品系葉片出現(xiàn)稀疏白斑，抗病品系葉片沒有變化，且葉綠素含量沒有明顯差別；接種侵染5 d時(shí)，感病品系葉片白斑增多，抗病品系葉片開始出現(xiàn)白斑；隨接種時(shí)間推移，在侵染7～10 d時(shí)，感病品系葉片可明顯觀察到白粉狀的塊斑，抗病品系葉片白斑緩慢增加，葉綠素含量開始下降；在侵染15 d時(shí)，感病品系葉片侵染白斑已經(jīng)布滿整個(gè)葉片，葉緣褶皺，質(zhì)脆而且堅(jiān)硬，逐漸變成褐黃色，葉綠素含量也明顯下降，抗病品系葉片出現(xiàn)白粉狀斑塊，葉緣褶皺。

2.3 白粉病菌侵染對籽用美洲南瓜葉片和MDA含量的影響

2.4 白粉病侵染后籽用美洲南瓜葉片組織化學(xué)染色觀察

a、i.接種0 h；b、j.接種12 h；c、k.接種 24 h；d、l.接種36 h；e、m.接種48 h；f、n.接種 72 h；g、o.接種 96 h；h、p.接種 120 h;M3.感病品系；F2.抗病品系；下同 圖1 籽用美洲南瓜與白粉病病原菌的互作a,i. Infected for 0 h; b,j. Infected for 12 h; c,k. Infected for 24 h; d,l. Infected for 36 h; e,m. Infected for 48 h; f,n. Infected for 72 h; g,o. Infected for 96 h; h,p. Infected for 120 h; M3. Susceptible line; F2. Resistant line; The same as belowFig.1 Interaction effect between Cucurbita pepo L. and Podosphaera xanthii

H2O表示噴施清水，P. xanthii表示噴施白粉病菌懸浮液；下同圖2 白粉病菌侵染后不同抗性籽用美洲南瓜葉片形態(tài)及葉綠素含量變化H2O means spraying water, P. xanthii means spraying powdery mildew suspension; The same as belowFig.2 Changes of leaf morphology and chlorophyll content of C. pepo L. with different resistance to powdery mildew

圖3 白粉病侵染后不同抗性籽用美洲南瓜葉片過氧化氫、超氧陰離子及丙二醛含量的變化Fig.3 Changes of hydrogen peroxide, superoxide anion and malondialdehyde contents in leaves of C. pepo L. with different resistance after powdery mildew infection

2.5 白粉病菌侵染對籽用美洲南瓜葉片防御酶活性的影響

2.5.1 抗氧化酶活性圖4顯示，籽用美洲南瓜抗、感病品系植株葉片抗氧化酶CAT、SOD、POD活性在噴施清水(對照)條件下均始終無明顯變化，且各抗氧化酶活性在品系間相近，而在接種白粉病菌后隨著處理時(shí)間的延長均呈先增加后降低的變化趨勢，且抗病品系始終明顯高于同期感病品系。同時(shí)，抗病品系F2葉片各抗氧化酶活性均比感病品系M3更快達(dá)到峰值，且抗病品系酶活性增加幅度均大于感病品系。以上結(jié)果表明在受到白粉病侵染時(shí)，籽用美洲南瓜抗性品系的保護(hù)酶活性明顯高于感病品系，更有利于其抑制活性氧的積累，保護(hù)植株免受侵害。

圖4 白粉病侵染后籽用美洲南瓜葉片抗氧化酶活性變化Fig.4 Changes of antioxidant enzyme activities in leaves of C. pepo L.seedling after powdery mildew infection

2.5.2 PAL和PPO活性如圖6所示，噴施清水處理的籽用美洲南瓜抗、感品系葉片中PAL、PPO兩種酶活性在整個(gè)接種期間都沒有發(fā)生明顯變化，且在同期兩個(gè)品系間比較接近。在接種白粉病菌初期，抗病品系PAL、PPO活性急劇增加，并于接種5 d達(dá)最大值后緩慢下降，但均明顯高于同期噴施清水對照水平；而感病品系葉片PAL活性在接種初期緩慢增長，并于接種5 d達(dá)最高峰后趨于平緩，其葉片PPO活性于接種7 d達(dá)到最大值后緩慢下降。這說明籽用美洲南瓜抗病品系被白粉病侵染時(shí)誘導(dǎo)葉片中PAL、PPO活性的迅速增強(qiáng)，促進(jìn)了抑菌物質(zhì)的形成，有效地抑制了白粉病病原菌的增殖[22-23]，達(dá)到抵御白粉病菌進(jìn)一步侵染的目的。

圖5 白粉病侵染后不同抗性籽用美洲南瓜葉片組織化學(xué)染色觀察Fig.5 Observation on histochemical staining of C. pepo L. leaves with different resistant seeds after powdery mildew infection

圖6 白粉病菌侵染后籽用美洲南瓜葉片苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性的變化Fig.6 Changes of PAL and PPO activities in leaves of C. pepo L. seedling after powdery mildew infection

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在白粉病侵染籽用美洲南瓜的過程中，感病品系在接種白粉病后12 h萌發(fā)出芽管， 24 h生成短小菌絲，48 h生成次生菌絲，72～96 h分生孢子開始萌發(fā)并持續(xù)生長，120 h形成密集分生孢子，這與高啟帆等[15]對白粉病侵染黃瓜的結(jié)論一致；而籽用美洲南瓜抗病品系較感病品系白粉病菌發(fā)育緩慢，于接種72 h才形成短小菌絲，120 h次生菌絲才出現(xiàn)。說明白粉病菌接種在不同抗性籽用美洲南瓜品系后，其生長變化與品系最初抗性具有一定關(guān)系，這與郭衛(wèi)麗等[16]對白粉菌侵染南瓜的結(jié)論一致。

另外，植物正常生長發(fā)育過程中細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，而逆境可以打破這種平衡狀態(tài)[22]，致使過多的活性氧積累，從而對細(xì)胞膜產(chǎn)生毒害作用，而植物體內(nèi)的SOD、POD和CAT可以使活性氧維持到正常水平[23]，且CAT、SOD、POD活性與植物抵抗病原菌侵染的能力呈正相關(guān)[24]。本研究中，噴施清水的籽用美洲南瓜抗、感品系植株葉片CAT、SOD、POD活性均無明顯變化，接種白粉病的抗病植株葉片CAT、SOD和POD活性在3 d時(shí)達(dá)到最大值，而感病品種葉片CAT、SOD活性于接種5 d時(shí)達(dá)最大值，POD活性于接種7 d時(shí)達(dá)最大值。表明籽用美洲南瓜抗病品系F2葉片中的活性氧清除系統(tǒng)響應(yīng)速度比感病品系更快，植株體內(nèi)保護(hù)酶活性的高低與品系抗性有關(guān)。這與楊瑞平等[25]研究結(jié)果一致。

此外，PAL是能夠促進(jìn)酚類物質(zhì)氧化形成木質(zhì)素，而木質(zhì)素可以在被侵染部位大量積累，從而抑制病原菌的繁殖[26]。PPO可以催化合成具有抗菌作用的物質(zhì)，其酶活性的高低與植物的抗病性密切相關(guān)[27]。因此，PAL和PPO可以作為衡量南瓜白粉病抗性的一個(gè)指標(biāo)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在接種白粉病菌后，不同抗性籽用美洲南瓜品系葉片PPO和PAL活性在一定時(shí)期內(nèi)均較對照明顯升高，且抗病品系加幅度大于感病品系。說明抗病籽用美洲南瓜品系在受到白粉病菌侵染后，其體內(nèi)PAL、PPO活性迅速增加以抵御病原菌的入侵，保護(hù)植株免受病原菌的侵染傷害。