模擬干旱脅迫處理下北柴胡種苗MYC2基因的調(diào)控研究

王 晨，胡珊群，李 彤，劉長利*

(1 首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院, 北京 100069; 2 中醫(yī)絡(luò)病研究北京重點(diǎn)實驗室, 北京 100069)

柴胡是中國常用大宗中藥材，藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣等功效，是中醫(yī)臨床治療少陽證的首選藥物。國家藥典收錄來源于傘形科柴胡屬多年生草本植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWild.)，其中柴胡是中藥柴胡的主要基原，習(xí)稱為“北柴胡”。柴胡皂苷(saikosaponin, SS)是從中藥柴胡中提取的三萜皂苷類化合物，其中柴胡皂苷a、d是國家藥典規(guī)定檢測柴胡質(zhì)量的指標(biāo)性成分和國內(nèi)外研究熱點(diǎn)的生物活性成分[1]。

茉莉酸(jasmonate acid, JA)及其衍生物茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)是植物在生物或非生物脅迫下抵御逆境條件的一個重要信號分子，它能夠激活許多相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)。髓細(xì)胞組織增生蛋白(myelocytomatosis proteins, MYCs)轉(zhuǎn)錄因子在植物JA信號途徑中處于重要位置，同時參與了多種信號途徑之間的相互作用，其功能與植物激素應(yīng)答、植物抗逆響應(yīng)等密切相關(guān)[2]。MYC2是植物JA信號通路中核心轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)感應(yīng)到來自外界的某些微生物、食草動物和機(jī)械損害、溫度變化、干旱脅迫、鹽脅迫等信號時，JA可在植物體內(nèi)通過酶的作用甲基化生成MeJA，MeJA作為信號分子可進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)酯酶水解成JA，進(jìn)而在Jar l (Jasmonic acid resistant 1, Jar l)酶的作用下與異亮氨酸(isoleucine, Ile)結(jié)合生成JA-Ile (JA-isoleucine, JA-Ile)。JA-Ile可與Skpl/Cullin l/F-box protein COI l(SCFCOI1)受體以及抑制蛋白(Jasmonate ZIM-domain, JAZ)結(jié)合[3]。JAZ蛋白是MYC2的抑制劑，當(dāng)兩者結(jié)合在一起的時候，MYC2的轉(zhuǎn)錄激活作用被抑制[4]。JA-Ile和SCFCOI1、JAZ蛋白結(jié)合以后，JAZ蛋白被泛素化和降解，MYC2被釋放出來，進(jìn)而與下游關(guān)鍵基因的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，從而影響植物的生長發(fā)育、對生物與非生物脅迫的反應(yīng)及次生代謝產(chǎn)物的合成等[5]。本課題組前期已成功克隆一條北柴胡MYC2基因(BcMYC2, GenBank accession number MT349674)，并初步明確其可響應(yīng)JA信號，參與調(diào)控柴胡皂苷的生物合成[6]。

植物在生物或非生物脅迫下，茉莉酸信號通路被激活，內(nèi)源茉莉酸類物質(zhì)等信號分子含量增高，釋放出相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，激活植物次生代謝中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的合成并積累。干旱脅迫可影響植物生理功能，也是研究最多的逆境因子之一。目前在玉米[6]、梭梭[7]等植物中已驗證轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控植物在干旱脅迫下的生理功能。因此，本研究選用聚乙二醇PEG6000作為模擬干旱脅迫滲透劑對北柴胡根部進(jìn)行脅迫處理，在10%、20%濃度PEG6000脅迫處理不同時間后取樣，用于檢測信號物質(zhì)OPR、JA含量，BcMYC2及各關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量，并且在脅迫0、1、3、6、12、24、36 d后取樣，干燥后用于柴胡皂苷a、d含量分析，旨在探究模擬干旱脅迫下北柴胡種苗內(nèi)茉莉酸信號通路調(diào)控BcMYC2，進(jìn)而影響柴胡皂苷生物合成的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和試劑

試驗材料一年生北柴胡于2020年10月采挖自北京市延慶區(qū)艾藥園。經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)教授鑒定為北柴胡。Eastep Super總RNA提取試劑盒購自普洛麥格(上海)生物技術(shù)有限公司，KAPA SYBR?FAST Universal購自KAPA公司，F(xiàn)astKing RT Kit (With gDNase)試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Hoagland’s(霍格蘭氏)營養(yǎng)液購自雷根生物技術(shù)有限公司(北京)，聚乙二醇(PEG)6000購自蘭博利德生物技術(shù)有限公司(北京)，植物12-氧-植物二烯酸還原酶(OPR)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自酶免實業(yè)有限公司(江蘇)，植物茉莉酸酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自酶聯(lián)生物科技有限公司(上海)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自Biological Industries公司，柴胡皂苷a、d標(biāo)品購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇、甲酸、氨水購自北京化工廠，乙腈購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 模擬干旱脅迫處理

(1)種苗選擇：將從北京市延慶區(qū)艾藥園挖取的一年生北柴胡種苗清洗干凈，擦干稱重，從中挑選生長態(tài)勢均一，質(zhì)量在2.0～4.0 g的植株備用，將挑選后的植株置于1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，適應(yīng)環(huán)境。

(2)Hoagland’s營養(yǎng)液配制：取適量的Hoagland’s 大量元素溶液、鐵鹽母液(400x)、微量元素母液(400x)，按398∶1∶1的比例充分混合，即為Hoagland’s營養(yǎng)液原液，將原液與蒸餾水按1∶3的比例充分混勻稀釋得1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液。

(3)脅迫處理液配制：將稱重后的PEG6000溶解于1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%的PEG6000溶液，即為模擬干旱脅迫處理液。

(4)脅迫處理及取樣：將北柴胡種苗分別置于對照組(1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液)及含10%、20% PEG的1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液的150 mL錐形瓶中誘導(dǎo)，以北柴胡根部接觸營養(yǎng)液。分別于脅迫處理0、2、4、6、8、10、12 h取北柴胡根部組織，每份樣品取自3株不同植株，放入離心管中，液氮冷凍后放入-80 ℃冰箱備用。

1.3 北柴胡根中OPR和內(nèi)源茉莉酸含量測定

1.3.1 北柴胡根中OPR含量使用植物12-氧-植物二烯酸還原酶(OPR)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Elisa試劑盒)檢測北柴胡根中內(nèi)源OPR含量。將北柴胡的根解凍后精密稱重裝入2 mL離心管中，使用球磨機(jī)研磨至粉末。向離心管中加入1.5 mL提取液(提取液體積比為甲醇∶水∶甲酸=15∶4∶1)，超聲提取30 min。將樣品架于80 ℃水浴鍋中揮干提取液，揮干后每份樣品加入100 μL PBS，離心取上清液即得待測樣品。按試劑盒操作步驟使用酶標(biāo)儀檢測毛狀根中內(nèi)源OPR含量。

結(jié)果計算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在ElisaCalc軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定直線回歸方程式。根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)應(yīng)在0.95以上。

1.3.2 北柴胡根中內(nèi)源茉莉酸含量以1.3.1中所得上清液為待測樣品，使用植物茉莉酸酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測北柴胡種苗根中內(nèi)源茉莉酸含量。按試劑盒操作步驟使用酶標(biāo)儀檢測毛狀根中內(nèi)源茉莉酸含量。

結(jié)果計算：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線線形回歸方程，按曲線方程計算各樣本濃度值。標(biāo)準(zhǔn)品線形回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于等于0.990 0。

1.4 北柴胡根中BcMYC2及柴胡皂苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的相對表達(dá)量分析

使用Eastep Super總RNA提取試劑盒提取毛狀根RNA。使用FastKing RT Kit (With gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)為cDNA。使用Quant Studio 5儀器進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)基因序列利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物；根據(jù)BcMYC2、Actin(GenBank accession number FJ389747)[8]、HMGR(GenBank accession number EU400217)[9]、IPPI(GenBank accession number EU400218)[10]、FPS(GenBank accession number EU400219)[8]、β-AS(GenBank accession number EU400200)[11]核苷酸序列設(shè)計引物，引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。使用表1內(nèi)引物序列采用RT-PCR法檢測BcMYC2及HMGR、IPPI、FPS、β-AS基因的相對表達(dá)量。

以Actin基因為內(nèi)參，將cDNA用無菌水稀釋10倍為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR (quantitative real time PCR, qRT-PCR)反應(yīng)。qRT-PCR體系包括：10.0 μL 2×Fast qPCR Master Mix， 0.4 μL Gene-qF， 0.4 μL Gene-qR， 1.0 μL cDNA， 0.4 μL 50×Rox Low， 7.8 μL ddH2O， 總體積為20.0 μL；qRT-PCR程序為：保溫階段：Step 1：95.0 ℃ 3 min，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)階段Step 1：95.0 ℃，3 s； Step 2：60.0 ℃，30 s，熔解曲線測定階段Step 1：95.0 ℃，1 s，Step 2：60.0 ℃，20 s， Step 3：95.0 ℃，1 s?；虮磉_(dá)量運(yùn)用“ΔΔCT”法[12]進(jìn)行分析。

1.5 北柴胡根中柴胡皂苷含量測定

1.5.1 脅迫處理、取樣及制備采用1.2中方法用廣口瓶進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，分別于脅迫處理0、1、3、6、12、24、36 d取北柴胡根部組織材料(每份材料取自3株不同植物)，將根部營養(yǎng)液擦干后放入-80 ℃冰箱備用。每隔6 d更換廣口瓶中營養(yǎng)液，但發(fā)現(xiàn)處理12 d后，置于1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液中的北柴胡根出現(xiàn)局部逐漸腐爛現(xiàn)象，取樣時將腐敗部分去除后放入冰箱備用。將全部樣品從-80 ℃冰箱取出，標(biāo)記后裝入信封中，放入烘箱烘干。烘干后的樣品使用枝剪剪成段，放入混合型碾磨儀中粉碎1 min后備用。

表1 本試驗所用引物

1.5.2 柴胡皂苷含量測定精密稱取粉碎后的樣品，每份0.2 g左右，提取、檢測北柴胡根中柴胡皂苷a、d含量，HPLC檢測條件中對照品溶液取15 μL進(jìn)樣。

(1)對照品及供試品溶液制備：分別精密稱取柴胡皂苷a、d對照品5.71、5.66 mg，分別于5 mL容量瓶中用分析純甲醇制成濃度為1.040 mg·mL-1、1.084 mg·mL-1的溶液，搖勻，作為柴胡皂苷對照品溶液。精密稱取全部干燥后的北柴胡根樣品粉末于具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液10 mL，密塞，超聲處理30 min，抽濾后旋蒸回收溶劑，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[1]。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：從柴胡皂苷a溶液中精密吸取500、200、50、25、10 μL對照品溶液，從柴胡皂苷d溶液中精密吸取200、100、12.5、10、5 μL對照品溶液分別置于5 mL容量瓶中，并用分析純甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得到對照品溶液，取15 μL按HPLC色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，溶液中物質(zhì)的量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.003 1X-0.086 5；柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.002 5X+0.051，r=0.999 9。

(3)HPLC色譜條件：Agilent1200高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；檢測波長為210 nm；流動相為純水(A)乙腈(B)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；洗脫方式為梯度洗脫，具體梯度洗脫方式為：0～5 min， A%為75%～65%， B%為25%～35%；5～20 min， A%為65%～60%， B%為35%～40%；20～30 min， A%為60%～40%， B%為40%～60%；30～35min， A%為40%～0%， B%為60%～100%；35～40 min， A%為0%， B%為100%

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS Statistics 17軟件中的單因素ANOVA分析方法，輸入數(shù)據(jù)經(jīng)軟件計算得P值，判斷數(shù)據(jù)組間是否有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬干旱脅迫對北柴胡根中OPR含量的影響

采用ELISA試劑盒法測定北柴胡根中OPR含量，構(gòu)建的OPR含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.029 89+261.145 07X(R2=0.982 11)，符合試劑盒中說明書要求；OPR含量在PEG6000處理不同時間的表達(dá)情況如圖1所示。其中，對照組北柴胡根中OPR含量在檢測期間比較穩(wěn)定，基本在1.37～1.38 ng·g-1范圍內(nèi)小幅波動。經(jīng)10%、20% PEG6000處理0～2 h后，北柴胡根內(nèi)OPR含量呈逐漸升高趨勢并高于對照組，20% PEG6000處理組在2 h處出現(xiàn)峰值(1.944 ng·g-1)，10% PEG6000處理組在2 h處OPR含量為1.471 ng·g-1，但不是該處理組的峰值。在2～4 h處理區(qū)間，兩處理組北柴胡根中OPR含量均明顯下降，大幅低于對照組。20% PEG6000處理組內(nèi)源OPR含量在4 h后逐漸上升，之后趨于穩(wěn)定；而10% PEG6000處理組OPR含量在4 h后快速上升，于6 h時處達(dá)到峰值(1.548 ng·g-1)，而在6～10 h之間再次大幅下降，之后又上升并接近對照組水平。20% PEG6000處理組內(nèi)源OPR含量出現(xiàn)峰值的時間早于10% PEG6000處理組，且峰值高于10% PEG6000處理組。

2.2 干旱脅迫對北柴胡根中內(nèi)源茉莉酸含量的影響

采用ELISA試劑盒法測定北柴胡根中內(nèi)源茉莉酸含量，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.042 5+10.473 23X-17.648 92X2(R2=0.997 88)，符合試劑盒中說明書要求。檢測得到的內(nèi)源茉莉酸含量在PEG6000處理下不同時間的表達(dá)情況如圖2所示。其中，對照組柴胡根內(nèi)源茉莉酸含量在脅迫處理0～8 h之間逐漸下降，在8～12 h之間又逐漸上升。經(jīng)模擬干旱脅迫處理后，北柴胡根中內(nèi)源茉莉酸含量在0～2 h間呈逐漸升高趨勢，10%、20% PEG6000處理組均在2 h處出現(xiàn)峰值，分別達(dá)到135.220和141.857 ng·g-1。20% PEG6000處理組根中內(nèi)源茉莉酸含量在干旱脅迫2～4 h期間大幅下降，在4～6 h間快速上升，于6 h時達(dá)到第二個峰值(102.642 ng·g-1)，之后再下降(6～8 h)，然后緩慢上升(8～12 h)。10% PEG6000處理組內(nèi)源茉莉酸含量在處理2 h達(dá)峰值后逐漸下降，于10 h降至最低值，之后在10～12 h間又有所上升。

圖1 模擬干旱脅迫處理下不同時間北柴胡根中OPR的含量變化Fig.1 Changes of OPR content in the roots of Bupleurum chinense at different time points under drought stress

圖2 模擬干旱脅迫處理下不同時段北柴胡根中內(nèi)源茉莉酸的含量變化Fig.2 Changes of endogenous JA content in the roots of B. chinense at different time points under drought stress

2.3 干旱脅迫對BcMYC2及柴胡皂苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的相對表達(dá)量影響

圖3，A顯示，BcMYC2基因相對表達(dá)量在PEG6000處理2 h時最高，此時20% PEG6000和10% PEG6000處理組遠(yuǎn)高于對照組，而20% PEG6000處理又高于10% PEG6000處理； 20%和10% PEG6000處理組BcMYC2基因相對表達(dá)量在處理2～4 h期間大幅下降，在處理4 h之后小幅波動整體趨于平緩，10% PEG6000處理的基因相對表達(dá)量在4～8 h間略有波動。

同時，柴胡皂苷生物合成途徑中4個關(guān)鍵酶基因HMGR、FPS、IPPI、β-AS在20%和10% PEG6000處理下的表達(dá)情況如圖3，B-E所示。其中，20% PEG6000處理組4個關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在脅迫4 h處，而10% PEG6000處理組各關(guān)鍵酶基因表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在脅迫6 h處，且各基因相對表達(dá)量峰值處表現(xiàn)為20% PEG6000處理組的高于10% PEG6000處理組，10% PEG6000處理組又高于對照組。具體而言，HMGR基因相對表達(dá)量在兩個PEG6000處理組中峰值過后趨于穩(wěn)定，而對照組的表達(dá)量在實驗過程基本穩(wěn)定。IPPI基因相對表達(dá)量在20% PEG6000處理組于4 h達(dá)到峰值后，在4～6 h間快速下降，但在6～8 h間逐漸上升，并在8 h處出現(xiàn)第2個峰值，而其低于4 h處的峰值。FPS基因相對表達(dá)量在10% PEG6000處理組中于2 h處有一個峰值，但此時的表達(dá)量遠(yuǎn)低于6 h處的表達(dá)量；FPS基因相對表達(dá)量在20% PEG6000處理組于8 h處出現(xiàn)第2個峰值，但其表達(dá)量遠(yuǎn)低于4 h處的峰值。β-AS相對表達(dá)量在10% PEG6000處理組中于2～6 h處于較高水平，于6～8 h間快速下降，8～12 h再次處于上升趨勢。

以上模擬干旱脅迫處理結(jié)果表明，北柴胡根系BcMYC2表達(dá)量在處理組與對照組間有顯著性差異，說明適度干旱脅迫可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子BcMYC2的表達(dá)；柴胡皂苷生物合成途徑中4個關(guān)鍵酶基因HMRG、IPPI、FPS、β-AS相對表達(dá)量在20% PEG6000處理4 h時與對照組有顯著性差異，在10% PEG6000處理6 h后與對照組存在顯著性差異。整體上來看，關(guān)鍵酶基因表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時間晚于BcMYC2基因表達(dá)量的峰值出現(xiàn)時間，說明BcMYC2可能參與調(diào)控關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。

2.4 干旱脅迫處理對北柴胡根中柴胡皂苷含量的影響

從圖4可知，10%和20% PEG6000模擬干旱脅迫后北柴胡根中柴胡皂苷a、d含量在36 d內(nèi)表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(圖4，A-C)。其中，在干旱脅迫開始時(0 d)，對照組及處理組柴胡皂苷a、d含量均分別約為4.0、5.0 mg·g-1。在干旱脅迫期間，20% PEG6000處理組柴胡皂苷合成速率高于10% PEG6000處理組和對照組，柴胡皂苷a、d含量整體較高。在干旱脅迫36 d后，柴胡皂苷a、d和a+d含量在20% PEG6000處理組中分別達(dá)到9.17、11.31、20.48 mg·g-1，在10% PEG6000處理組分別達(dá)到8.09、10.07、18.17 mg·g-1；此時兩處理組各項柴胡皂苷含量明顯高于相應(yīng)對照組，且差異均達(dá)到顯著水平。另外，干旱脅迫12 d時，柴胡皂苷含量積累速度下降，特別是對照組中柴胡皂苷d含量在脅迫12 d后表現(xiàn)出逐漸下降趨勢，推測可能與北柴胡根在脅迫12 d后逐漸出現(xiàn)腐爛有關(guān)。

圖3 模擬干旱脅迫處理下不同時間BcMYC2基因及柴胡皂苷合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量變化Fig.3 Changes in expression of BcMYC2 gene and key enzyme genes in saikosaponin synthesis pathway at different time points under simulated drought stress

*表示同期處理與對照間在0.05水平存在顯著性差異圖4 模擬干旱脅迫處理下不同時間北柴胡根內(nèi)柴胡皂苷含量的變化* indicates significant difference between treatment and control within same time point at 0.05 levelFig.4 Changes of saikosaponins in the roots of B. chinense at different time points under simulated drought stress

3 討 論

植物在生物或非生物脅迫下，茉莉酸信號通路被激活，內(nèi)源茉莉酸類物質(zhì)等信號分子含量升高，釋放出相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，刺激植物次生代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的合成并積累[13]。茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯等茉莉酸鹽類是由亞麻酸途徑衍生而來，其具有環(huán)戊酮基。茉莉酸鹽類廣泛存在于植物界，對其調(diào)控機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸鹽可調(diào)控多種基因的表達(dá)，主要可分為兩大類：一類與植物自身的生長發(fā)育有關(guān)，如種子的萌發(fā)、花粉及花的發(fā)育、果實的成熟等；另外一類與植物的防御有關(guān)，如病蟲害、機(jī)械損傷、干旱脅迫及鹽脅迫等[14]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時，抗逆基因表達(dá)可產(chǎn)生一些特有的次生代謝產(chǎn)物。這些次生代謝產(chǎn)物不是植物生長發(fā)育所必需的，但卻在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，也被廣泛應(yīng)用于藥物、香料及化工產(chǎn)品。例如，加入外源茉莉酸可促進(jìn)珍貴的藥用真菌牛樟芝產(chǎn)生總?cè)萍岸嗵荹15]。植物方面如微型月季受茉莉酸處理后，可激發(fā)萜類次生代謝產(chǎn)物的合成，這些萜類化合物可用于玫瑰精油的制作[16]。

Yu等[17]實驗發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族可與目的基因啟動子區(qū)域的E-box或G-box結(jié)合(G-box是E-box的其中一種)，進(jìn)而提高基因的表達(dá)量。E-box是基因啟動子區(qū)域上游通常存在的結(jié)構(gòu)，由CNNTG 6個堿基排列成特殊回文序列[18]。能夠被轉(zhuǎn)錄因子識別并結(jié)合，進(jìn)而激活基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BcMYC2基因表達(dá)量提高后與關(guān)鍵酶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，不同基因啟動子區(qū)域的E-box或G-box數(shù)量不同，所以對HMGR、IPPI、FPS、β-AS基因表達(dá)量的影響有強(qiáng)有弱。

在本研究的模擬干旱脅迫試驗中，為了給田間種植的北柴胡種苗提供適宜的人工培養(yǎng)條件使用了Hoagland’s營養(yǎng)液，Hoagland’s營養(yǎng)液是植物營養(yǎng)液中最常用的一種配方。為了使用方便、簡化操作、用量準(zhǔn)確、減少誤差，直接購買了含植物所需的大量無機(jī)元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物的母液，使用母液直接配制1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液。Hoagland’s營養(yǎng)液可提供柴胡生長所需物質(zhì)，但柴胡習(xí)性是耐干旱怕水澇。本研究使用的北柴胡種苗在北京市延慶區(qū)田間肥沃疏松的砂質(zhì)土壤中種植，而排水不良會導(dǎo)致柴胡根部發(fā)生腐病造成死亡[19]。因此，選擇田間種植生長態(tài)勢均一的北柴胡種苗置于1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液培養(yǎng)，會造成北柴胡根部一直處于水澇狀態(tài)，在脅迫12 d后開始逐漸腐爛對柴胡根部柴胡皂苷a、d含量產(chǎn)生不良影響。PEG6000可作為滲透調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液的滲透壓模擬干旱脅迫實驗，柴胡適應(yīng)性較強(qiáng)耐干旱耐貧瘠，因此在10%、20% PEG6000溶液中生長態(tài)勢好于1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液培養(yǎng)，36 d內(nèi)未出現(xiàn)腐爛并且根部柴胡皂苷a、d含量逐漸積累。韓曉偉等[20]采用盆栽控水法對北柴胡進(jìn)行干旱脅迫實驗，結(jié)果顯示適度干旱時(土壤飽和含水量40%～50%)柴胡皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量顯著提高，柴胡皂苷含量也隨之提高。

干旱脅迫是常見的非生物脅迫方式，對植物的生長發(fā)育過程和次生代謝物的合成有重要影響，本實驗推測當(dāng)柴胡感受外界干旱脅迫信號時體內(nèi)茉莉酸類化合物生物合成途徑啟動，JAZ蛋白被泛素化和降解，從而激活被JAZ等抑制蛋白結(jié)合的BcMYC2轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子通過與柴胡皂苷生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因啟動子部分E-box或G-box結(jié)合，調(diào)控關(guān)鍵酶基因的表達(dá)；本實驗研究結(jié)果顯示，BcMYC2轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫2 h時出現(xiàn)峰值，4個柴胡皂苷生物合成途徑上的基因HMGR、IPPI、FPS、β-AS的相對表達(dá)量在干旱脅迫過程中均有不同程度增加，最終促進(jìn)柴胡皂苷的合成并積累。本次實驗中對照組在1/4 Hoagland’s營養(yǎng)液中培養(yǎng)存在的腐敗現(xiàn)象應(yīng)在后續(xù)實驗中加以改進(jìn)，如可采用盆栽控水法進(jìn)行干旱脅迫實驗，相比將田間栽培的北柴胡置于營養(yǎng)液中植物更適應(yīng)在土壤中生長。另外，也可直接在實驗室播種北柴胡種苗或通過無菌播種的方法得到北柴胡種苗，進(jìn)而在實驗室條件下進(jìn)行干旱脅迫實驗更能保證實驗條件可控，即選擇的北柴胡種苗生長態(tài)勢均一。