黃枝瑚菌多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究*

周 蓉， 祝佳惠， 李玉芹， 唐裕芳， 陳禧瑤

(湘潭大學(xué) 化工學(xué)院 生物與食品工程系，湖南 湘潭 411105)

0 引言

枝瑚菌屬珊瑚菌科，枝瑚菌屬，子實(shí)體形秀色美、質(zhì)地鮮甜脆爽，富含數(shù)種必需氨基酸、有益碳水化合物和微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[1].中醫(yī)文獻(xiàn)記載其可以和胃現(xiàn)氣、祛風(fēng)、破血緩中[2]，近年來(lái)的報(bào)道表明部分枝瑚菌具有抗氧化、降血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫等功能，對(duì)艾氏癌EC和小鼠肉瘤S-l80也有很強(qiáng)抑制作用[3-4].豐富的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值使其成為我國(guó)野生食藥用真菌資源中極其寶貴的組成部分.

多糖是食藥用真菌發(fā)揮保健和醫(yī)療功能的重要成分，且對(duì)人體毒副作用較小，近年來(lái)成為功能性食品、天然藥物和保健品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前更是已將源自香菇、銀耳、靈芝、灰樹花等的多糖應(yīng)用于臨床領(lǐng)域.對(duì)枝瑚菌屬而言，現(xiàn)已有子實(shí)體多糖提取和活性相關(guān)的研究報(bào)道，如蘇鳳賢等[5]優(yōu)化了密枝瑚菌(R.stricta)多糖的提取工藝；王麗娟等[6]發(fā)現(xiàn)紅頂枝瑚菌(R.botrytoides)多糖具有羥基自由基(·OH)清除活性；董明明等[4]證實(shí)萎垂白枝瑚菌(R.flaccida)多糖具有良好的免疫增強(qiáng)功能.然而，黃枝瑚菌(R.flava)作為一類味道鮮美、效用良好的食材及傳統(tǒng)中藥材，在食品和中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但其子實(shí)體多糖研究較少，提取工藝的研究不夠深入.

本文以黃枝瑚菌為原料，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其子實(shí)體多糖的熱水浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察了優(yōu)化條件下多糖的抗氧化活性，為黃枝瑚菌的功效研究和其多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃枝瑚菌子實(shí)體，河南省南陽(yáng)市南召縣明存山貨店；DPPH、ABTS、還原型輔酶Ⅰ二鈉鹽(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氮藍(lán)四唑(NBT)，上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；Agilent Cary 3500型紫外-可見分光光度計(jì)；Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀；Netzsch TG209型同步熱重分析儀.

1.3 方法

1.3.1 熱水浸提黃枝瑚菌多糖黃枝瑚菌子實(shí)體烘干、粉碎過(guò)篩后，按照所需料液比、浸提溫度和時(shí)間浸提兩次；浸提液合并濃縮后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜；離心(8 000 r/min，10 min)收集沉淀并用蒸餾水復(fù)溶，加入25% Sevage試劑(v(三氯甲烷)∶v(異丙醇)=4∶1)，重復(fù)數(shù)次后合并收集上層溶液；于4 ℃透析(截留分子量3 500 Da)48 h后，冷凍干燥即得黃枝瑚菌多糖.

1.3.2 多糖含量測(cè)定將上述透析后的多糖樣品定容后，采用蒽酮-硫酸法[7]測(cè)定溶液在620 nm波長(zhǎng)下的吸光值，根據(jù)同法所得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖得率，計(jì)算公式如下：

(1)

式中：C為樣品中多糖濃度,g/mL；V為定容體積,mL；N為稀釋倍數(shù)；M為子實(shí)體粉末干重，g.

1.3.3 提取工藝優(yōu)化

(1) 單因素試驗(yàn)

選取料液比、浸提溫度和時(shí)間3個(gè)因素，以多糖得率為考察指標(biāo)按以下條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)：1) 固定浸提時(shí)間4 h，料液比1∶25，浸提溫度分別為60、70、80、90、100 ℃；2) 固定浸提溫度80 ℃，料液比1∶25，分別浸提1、2、3、4、5 h；3) 固定浸提溫度80 ℃，浸提時(shí)間4 h，料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35.

(2) 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理以浸提溫度X1、浸提時(shí)間X2和料液比X3為自變量，多糖得率為響應(yīng)值Y，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)以優(yōu)化多糖浸提工藝.設(shè)計(jì)因素及水平見表1.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.3.4 熱重分析將多糖置于氧化鋁坩堝中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下以10 ℃/min的升溫速率利用同步熱重分析儀評(píng)估多糖在30～800 ℃間的質(zhì)量變化.

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析取2 mg多糖粉末與干燥KBr混合并壓片，在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描.

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

(1) DPPH·清除能力

將不同濃度的多糖溶液與DPPH-甲醇溶液等體積混合均勻，黑暗靜置30 min后測(cè)定OD517值.以L-抗壞血酸(Vc)為陽(yáng)性對(duì)照.

(2) ABTS+·清除能力

7.4 mmol/L的ABTS溶液與2.6 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混合后黑暗靜置12 h后制成ABTS+·工作液，將工作液與多糖溶液以體積比4∶1混合，避光靜置5 min后測(cè)定其OD734值.以Vc為陽(yáng)性對(duì)照.

(3) O2-·清除能力

(3)

向700 μL多糖溶液中依次加入78 μmol/L NADH溶液、50 μmol/L NBT溶液和10 μmol/L PMS溶液各100 μL，混勻后測(cè)定OD560值.以沒食子酸為陽(yáng)性對(duì)照.

多糖的自由基清除率根據(jù)式(2)計(jì)算.其中Ax為實(shí)驗(yàn)組吸光值，Ax0為陰性對(duì)照組吸光值(無(wú)自由基)，A0為空白組吸光值(無(wú)樣品).

(2)

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)來(lái)表示，數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性評(píng)價(jià)，其中響應(yīng)面試驗(yàn)利用Design Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

浸提時(shí)間對(duì)多糖得率影響的結(jié)果見圖1(a)：浸提時(shí)間從1 h逐漸增加到4 h，多糖得率顯著升高，在4 h時(shí)達(dá)到最大值11.49 mg/g，提升了120.96%，主要是由于浸提時(shí)間增加促使多糖在浸提液中充分溶解；但繼續(xù)增加浸提時(shí)間至5 h，多糖得率下降1.92 mg/g，其原因是浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起多糖的降解，產(chǎn)生部分小分子糖類，不利于在醇沉過(guò)程中回收[8].因此適宜的浸提時(shí)間為4 h.

圖1 浸提條件對(duì)黃枝瑚菌多糖得率的影響：(a) 浸提時(shí)間的影響；(b)浸提溫度的影響；(c)料液比的影響Fig.1 Effects of extraction conditions on the yield of polysaccharides from R. flava：(a) Effect of extraction time； (b) effect of extraction temperature；(c) effeet of solid liquid ratio

由圖1(b)可知，浸提溫度由60 ℃升高到90 ℃，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，利于多糖從細(xì)胞中溶出，得率逐漸升高，整體提升76.39%.繼續(xù)升溫至100 ℃，得率略有下降，其原因是隨著溫度的升高，多糖降解速率增加，最終表現(xiàn)為多糖的宏觀溶出速率減少、得率降低[9].又因較高浸提溫度會(huì)帶來(lái)較大能耗，因此浸提溫度的優(yōu)化范圍選擇70～90 ℃.

多糖得率在料液比1∶15～1∶30(g/mL)范圍內(nèi)隨溶劑比例的增加而升高，1∶30之后趨于平緩(圖1(c)).當(dāng)料液比低于1∶30時(shí)，溶劑比例增大使物料與提取液接觸愈加充分，多糖溶解率逐漸增加，得率顯著升高，最高為9.86 mg/g；但在多糖已充分溶出后繼續(xù)增大料液比，浸提液中多糖不再繼續(xù)增加，得率(9.87 mg/g，P>0.05)基本保持不變.而水量過(guò)多會(huì)增加濃縮成本，所以確定1∶30為適宜料液比水平.

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取浸提溫度(70～90 ℃)、浸提時(shí)間(3～5 h)、料液比(1∶25～1∶35)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，共17組試驗(yàn)，多糖得率為6.13～19.19 mg/g.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 回歸模型有效性及顯著性分析對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，可得如下多糖得率Y對(duì)浸提溫度X1、浸提時(shí)間X2和料液比X3的多項(xiàng)回歸方程：

Y=0.015+3.358×10-3X1+1.884×10-3X2+5.050×10-4X3-1.135×10-3X1X2

-1.230×10-3X1X3+1.172×10-3X2X3-1.798×10-3X12+8.954×10-4X22

-5.293×10-4X32.

對(duì)該模型進(jìn)行方差和顯著性分析(表3)可知，回歸模型的P=0.0031<0.01，極顯著，失擬項(xiàng)P=0.24>0.05，不顯著，說(shuō)明模型顯著可靠.決定系數(shù)R2為0.8971，說(shuō)明有89.71%的試驗(yàn)組結(jié)果落在樣本的回歸曲線上，模型與實(shí)際情況擬合較好，變異系數(shù)CV值為0.37%，表明變異程度較小，可信度高.同時(shí)表3顯示：一次項(xiàng)X1、X2極顯著(P<0.01)，且X1的F值較大，說(shuō)明浸提溫度對(duì)多糖得率的影響更顯著；二次項(xiàng)X12的P<0.05，表明各因素對(duì)多糖得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；但交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3均不顯著，又說(shuō)明各因素對(duì)響應(yīng)值影響的交互作用較弱.

2.2.3 響應(yīng)曲面分析響應(yīng)曲面和等高線圖是將回歸方程任一因素固定在0水平后的圖形表達(dá)形式.響應(yīng)曲面中曲線越陡峭說(shuō)明該因素對(duì)得率的影響越大.圖2顯示，曲線的陡峭程度最高為浸提溫度，最低為料液比，說(shuō)明各因素對(duì)多糖得率的影響程度為浸提溫度>浸提時(shí)間>料液比；另外，等高線圖的形狀越接近橢圓形說(shuō)明兩變量間交互作用越強(qiáng)，越接近圓形越弱，而圖2所示的等高線圖雖然都接近橢圓形，但弧度較緩，說(shuō)明各因素間存在一定的交互作用但程度較弱，與表3結(jié)果一致.

圖2 各因素交互作用對(duì)黃枝瑚菌多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線：(a) 浸提溫度-料液比的影響； (b)浸提溫度-浸提時(shí)間的影響；(c) 浸提時(shí)間-料液比的影響Fig.2 Response surface and contourlines of effects of various interactive factors on polysaccharide yield from R. flava： (a) Effect of extraction temperature-solid liquid ratio；(b) effect of extraction temperature-extraction time； (c) effect of extraction time-solid liquid ratio

2.2.4 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證通過(guò)Design Expert V8.0.6軟件分析，預(yù)測(cè)多糖最佳浸提條件為料液比(1∶34) g/mL，83 ℃下浸提5 h，該條件下多糖理論得率為19.26 mg/g.實(shí)際得率為(19.21±0.15) mg/g，與理論值僅相差0.05 mg/g，說(shuō)明該優(yōu)化方案可行.

2.3 熱重分析

圖3所示的熱重(TG)和微商熱重(DTG)曲線表征了多糖的溫度敏感性，其中有2次明顯的質(zhì)量損失：第一次是由于水分蒸發(fā)，多糖在30～100 ℃質(zhì)量損失8.77%，該結(jié)果暗示該多糖具有一定持水力，可應(yīng)用于酸乳和面制品中，以減少乳清析出，應(yīng)對(duì)面制品口感不佳、失水等問題[10]；由于多糖熱分解，217～800 ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)第二次質(zhì)量損失(84.11%)，并于308.67 ℃時(shí)達(dá)到最快熱分解速率.而在100～217 ℃范圍內(nèi)多糖質(zhì)量保持穩(wěn)定，表明一定程度的熱處理不會(huì)引起多糖的熱分解，其可應(yīng)用于需要一定高溫處理的領(lǐng)域，如需巴氏殺菌的食品及藥品.

圖3 黃枝瑚菌多糖TG和DTG曲線Fig.3 TG and DTG curves of polysaccharides from R. flava

2.4 紅外光譜分析

黃枝瑚菌多糖的紅外圖譜如圖4所示：3 440 cm-1和2 931 cm-1波數(shù)附近出現(xiàn)的強(qiáng)O—H和強(qiáng)C—H伸縮振動(dòng)吸收峰，是典型的多糖特征吸收[11].1 540、1 250 cm-1附近為酰胺Ⅱ、Ⅰ的酰胺鍵彎曲振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明多糖中可能含有蛋白質(zhì)[12].1 070 cm-1附近是C—O—C糖化鍵振動(dòng)和C—O—H拉伸振動(dòng)重疊的吡喃糖環(huán)振動(dòng)[13].1 650 cm-1和914 cm-1附近為C=O的伸縮振動(dòng)和二聚體羧酸O—H基面外變角振動(dòng)[14]，兩者表明多糖中含有糖醛酸.

圖4 黃枝瑚菌多糖的紅外圖譜Fig.4 FTIR of polysaccharides from R. flava

2.5 黃枝瑚菌多糖的抗氧化活性

2.5.1 對(duì)DPPH·的清除能力圖5(a)顯示，多糖對(duì)DPPH·的清除活性隨樣品濃度的升高而增大，125～500 μg/mL范圍內(nèi)，清除率增長(zhǎng)59.05%；500 ～1 000 μg/mL時(shí)，清除率僅增長(zhǎng)4.35%，但均在90%以上；當(dāng)濃度為1 000 μg/mL，達(dá)到最高清除率96.33%，基本與陽(yáng)性對(duì)照Vc持平，但明顯高于同濃度的葡萄色頂枝瑚菌和紅頂枝瑚菌子實(shí)體多糖對(duì)DPPH·的清除能力(約10%)[15-16].

圖5 黃枝瑚菌多糖的抗氧化活性：(a) DPPH·清除作用；(b)ABTS+·清除作用；(c)O2-·清除作用Fig.5 Antioxidant activities of polysaccharides from R. flava：The scavenging effect of DPPH·(a)；ABTS+·(b)；O2-·(c)

2.5.2 對(duì)ABTS+·的清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)ABTS+·的清除率也呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，250 μg/mL后趨于平穩(wěn)(圖5(b)).在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，清除率為55.04%～99.25%，最高活性基本與陽(yáng)性對(duì)照持平，遠(yuǎn)高于紅頂枝瑚菌多糖RBP-Ⅰ的清除率(10 mg/mL，15.71%)[16].

2.5.3 對(duì)O2-·的清除能力圖5(c)顯示多糖對(duì)O2-·的清除能力呈劑量依賴性.在測(cè)試范圍內(nèi)，清除率最高值為92.74%，其半抑制濃度(IC50)為232.08 μg/mL.可能由于83 ℃浸提5 h比沸水浸提2 h對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的影響小，本文枝瑚菌多糖對(duì)O2-·的清除能力優(yōu)于何榮軍等[17]從珊瑚菌中分離的多糖RFPF2A(IC50=2.5 mg/mL).

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定了黃枝瑚菌多糖的最佳熱水浸提工藝條件：浸提溫度83 ℃，浸提時(shí)間5 h，料液比(1∶34) g/mL，得率達(dá)19.21 mg/g，且其中浸提溫度為主要影響因素.同時(shí)，熱重分析結(jié)果顯示該多糖能耐受一定程度的高溫，可應(yīng)用于需要熱處理的食品和藥品領(lǐng)域.此提取方法簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、對(duì)多糖結(jié)構(gòu)影響小，可為其工業(yè)化提取提供理論與技術(shù)支撐.此外，該多糖具有明顯的多糖特征吸收峰，主要由吡喃糖構(gòu)成，可能含有少量蛋白質(zhì)和糖醛酸，且表現(xiàn)出較好的DPPH·、ABTS+·和 O2-·清除活性，具有作為天然抗氧化劑的潛力.本研究為黃枝瑚菌多糖在醫(yī)藥和功能性食品領(lǐng)域的綜合開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù).