QuEChERS-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鮮菜類調(diào)味品中10種殺菌劑殘留

張曉瑜，張 藝，王志昱，劉澤靜，國 凱，張桂芳

（煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心，山東 煙臺(tái) 264003）

鮮菜類調(diào)味品是指有特殊香味被直接用作調(diào)味品的新鮮蔬菜，也是部分醬腌菜的原料[1-2]，通常認(rèn)為包含蔥、姜、蒜、香菜、辣椒等，是我國居民日常生活中不可缺少的蔬菜品類，在我國各地都有使用此類蔬菜調(diào)味或者作為輔助食材的習(xí)慣。鮮菜類調(diào)味品的產(chǎn)量已經(jīng)占到中國蔬菜總產(chǎn)量的7%[3]。為避免種植、生長、采摘、運(yùn)輸過程中的害蟲、微生物的侵襲，鮮菜類調(diào)味品在種植、生產(chǎn)等環(huán)節(jié)會(huì)使用殺菌劑等農(nóng)藥[4-5]，殺菌劑殘留狀況不容樂觀[6-7]。目前使用率較高的廣譜殺菌劑如丙環(huán)唑[8]、苯醚甲環(huán)唑[9]、多菌靈、甲霜靈、嘧霉胺、三唑酮[10]、戊唑醇[11]、烯酰嗎啉、咪鮮胺、甲基硫菌靈等均有一定的毒性。但研究多集中在殺蟲劑的檢測(cè)[13-14]，鮮菜類調(diào)味品的檢測(cè)研究較少。

目前測(cè)定蔬菜中殺菌劑的檢測(cè)方法主要有分光光度法[15]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[16]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[17]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[18]、液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chro matography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[19]。常用分析方法中，分光光度法操作簡單但選擇性不高，易受本底干擾；高效液相法（HPLC）分離度好，但對(duì)樣品前處理要求高，基質(zhì)干擾大時(shí)易出現(xiàn)假陽性的情況；氣相色譜法（GC）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）僅適用于易揮發(fā)成分的測(cè)定，用于難揮發(fā)種類的殺菌劑檢測(cè)時(shí)需要提前進(jìn)行成分衍生化，操作繁瑣，耗時(shí)長，樣品回收率難以保證；液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）具有受基質(zhì)干擾小，抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。目前國標(biāo)GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[19]應(yīng)用廣泛，但該方法未包含常用的殺菌劑種類，且采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、固相萃取等方法進(jìn)行樣品前處理，因此存在樣品、溶劑用量大，操作費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。近年來，QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前處理方法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，能夠快速凈化樣品中的干擾雜質(zhì)[20]。由于鮮菜類調(diào)味品中富含的砜類、酯類、醚類、芳香性揮發(fā)油等揮發(fā)性化合物，常規(guī)前處理方式難以去除，對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)造成嚴(yán)重干擾[13]，有文獻(xiàn)表明，QuEChERS方法因其快速、簡便、具備多種可調(diào)的凈化試劑等優(yōu)勢(shì)，可有效凈化此類物質(zhì)[14]，成為鮮菜類調(diào)味品殺菌劑檢測(cè)理想的前處理方法。

本研究針對(duì)鮮菜類調(diào)味品復(fù)雜基質(zhì)的特點(diǎn)，摸索并優(yōu)化QuEChERS前處理方法和液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的色譜、質(zhì)譜條件，最終建立一種可同時(shí)測(cè)定鮮菜類調(diào)味中10種殺菌劑殘留的檢測(cè)方法。通過本研究，可以了解不同鮮菜類調(diào)味品中殘留的殺菌劑種類和濃度水平，以期檢測(cè)鮮菜類調(diào)味品中殺菌劑殘留的種類和水平，同時(shí)對(duì)完善限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔥、姜、蒜、香菜、辣椒：煙臺(tái)地區(qū)市場購買。

乙腈、甲酸（均為色譜純）：德國默克公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鎂（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）（40～63 μm），C18（石墨化碳黑）（graphitized carbon black，GCB）：德國CNW科技公司；實(shí)驗(yàn)用水均達(dá)到國標(biāo)GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中的一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。

丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、甲霜靈、嘧霉胺、三唑酮、戊唑醇、烯酰嗎啉、咪鮮胺、甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99%）：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260-G6460高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI））：美國安捷倫公司；3K15高速冷凍離心機(jī)：德國西格瑪公司；Multi Reax多通道渦旋振蕩器：德國海道爾夫公司；B-400均質(zhì)儀：瑞士BUCHI公司；AE100電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將適量樣品置于粉碎均質(zhì)器內(nèi)粉碎。取5.00 g均質(zhì)后樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋均勻，加入1 g氯化鈉，渦旋1 min，靜置至分層完全。取5 mL上清液冷藏至4 ℃，加入2 g無水硫酸鎂，渦旋1 min至分散完全，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液1.0 mL，加入60 mg PSA渦旋1 min，10 000 r/min離心3 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

使用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液制備混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 000 μg/L）；分別取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至空白樣品基質(zhì)（檢測(cè)不同種類的樣品需使用相應(yīng)種類的空白樣品基質(zhì)）中，獲得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列（目標(biāo)質(zhì)量濃度0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L）。

1.3.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq液相色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），采用梯度洗脫方法，流動(dòng)相A為0.05%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸/水，B為0.05%甲酸/乙腈，梯度洗脫程序見表1。設(shè)置后運(yùn)行時(shí)間2min，流速為0.300mL/min，進(jìn)樣量為2.0μL，柱溫為40 ℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Programs of gradient elution

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源、正離子模式掃描（ESI+），離子源溫度300 ℃，離子噴霧電壓4 000 V，霧化氣流速：氮?dú)猓∟2）流速5.0 mL/min，噴霧器壓力40 psi，脫溶劑氣流速：10.0 mL/min，脫溶劑氣溫度：400 ℃，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）正離子模式，離子對(duì)及碰撞能量等參數(shù)見表2。

表2 10種殺菌劑的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間Table 2 Mass spectrum parameters and retention time of the 10 fungicides

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化

選擇對(duì)殺菌劑溶解性能好的乙腈作為提取溶劑，乙腈在氯化鈉的參與下可以與水層較好的分離。本研究對(duì)QuEChERS前處理方法[20]中常用的試劑無水硫酸鎂、PSA、C18、GCB進(jìn)行考察。無水硫酸鎂用于去除基質(zhì)中的水分，但直接加入硫酸鎂會(huì)產(chǎn)生大量的熱，可能導(dǎo)致目標(biāo)化合物分解。本文通過對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)降溫和低溫離心的方式來減少硫酸鎂吸水放熱的影響；PSA用于吸附基質(zhì)中的碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類和少量的色素。本研究空白試樣為蔥，加標(biāo)水平為20 μg/L，通過采用測(cè)定加標(biāo)回收率的方式對(duì)PSA加入量進(jìn)行考察，結(jié)果見圖1。由圖1可知，PSA加入量為60 mg時(shí)，能夠有效提高10種殺菌劑的回收率（P＜0.05）；GCB主要用于去除色素、甾醇類和非極性干擾物，其對(duì)多種殺菌劑回收率影響嚴(yán)重；C18對(duì)回收率影響不大。所以本研究最終選用氯化鈉、硫酸鎂、PSA作為凈化方案。

圖1 不同PSA加入量對(duì)測(cè)定結(jié)果加標(biāo)回收率的影響Fig.1 Effect of different PSA addition on adding standard recovery of determination results

2.2 質(zhì)譜及色譜條件選擇

在質(zhì)譜電噴霧離子源正模式下分別對(duì)10種殺菌劑進(jìn)行全掃描（full scan），選出適宜的母離子（均為[M+H]+）。在子離子掃描模式下，通過優(yōu)化碰撞能（collision energy）和碎裂電壓（fragmentor）等條件，選擇合適定性離子與定量離子。在MRM正離子模式下對(duì)駐留時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，獲得良好的響應(yīng)與峰形。優(yōu)化得到的相關(guān)質(zhì)譜條件見表2，MRM質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 10種殺菌劑在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of 10 fungicides under multiple reaction monitoring mode

采用上述優(yōu)化質(zhì)譜條件下，對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行液相色譜檢測(cè)。采用體積分?jǐn)?shù)為0.05%甲酸/水及0.05%甲酸/乙腈進(jìn)行梯度洗脫，通過不斷優(yōu)化梯度洗脫程序獲得較為理想的峰形及信噪比，使10種殺菌劑可在色譜上較好的分離。梯度洗脫程序見表1，加標(biāo)樣品（加標(biāo)水平20 μg/L）色譜圖見圖3。

圖3 10種殺菌劑在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of 10 fungicides under multiple reaction monitoring mode

2.3 檢測(cè)方法的線性關(guān)系和檢出限

按照1.3.2的方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液（空白基質(zhì)為蔥），按上述儀器條件上機(jī)測(cè)試，以質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。同時(shí)以3倍信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）計(jì)算檢測(cè)方法檢出限，結(jié)果見表3。由表3可知，10種殺菌劑在0.2～60 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，可滿足準(zhǔn)確定量的要求。10種殺菌劑的檢出限為0.2～0.6 μg/kg。

表3 10種殺菌劑的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 3 Linear regression equations,linear range,correlation coefficient and detection limits of 10 fungicides

2.4 加標(biāo)回收率和方法精密度

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和精密度，選取蔥、姜、蒜、香菜、辣椒五種陰性樣品分別添加殺菌劑做加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為2 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg，重復(fù)6次。如表4中所示，加標(biāo)回收率為73.0%～104.7%，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.9%～9.8%。試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法的準(zhǔn)確性和精密度可滿足殺菌劑定量分析的要求[21]。

表4 10種殺菌劑的精密度及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of precision and standard recovery rates tests of 10 fungicides

續(xù)表

2.5 實(shí)際樣品分析

隨機(jī)抽取市售鮮菜類調(diào)味品20份，其中包含蔥、姜、蒜、香菜、辣椒各4份，應(yīng)用本方法進(jìn)行測(cè)定。20份樣品中4份樣品有殺菌劑檢出，其中蔥中檢出多菌靈（57.6 μg/kg）一份，香菜中檢出苯醚甲環(huán)唑（85.7 μg/kg）一份，大蒜中檢出烯酰嗎啉（28.1 μg/kg、101 μg/kg）兩份。依據(jù)GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[22]的要求，大蒜中檢出的烯酰嗎啉低于限量值（0.6 mg/kg），其他兩種檢出農(nóng)藥無限量值要求。

3 結(jié)論

本研究以煙臺(tái)地區(qū)鮮菜類調(diào)味品為樣本，對(duì)QuEChERS法的試劑進(jìn)行考察，確定提取鮮菜類調(diào)味品中殺菌劑的最優(yōu)前處理方法，結(jié)合液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀建立了同時(shí)檢測(cè)鮮菜類調(diào)味品中10種殺菌劑殘留的快速檢測(cè)方法。10種殺菌劑在測(cè)定范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，檢出限為0.2～0.6 μg/kg，加標(biāo)回收率為73.0%～104.7%，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%～9.8%。該方法與現(xiàn)行國標(biāo)方法[15-19]相比可同時(shí)測(cè)定10種常見殺菌劑，并且有前處理耗時(shí)短、準(zhǔn)確性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，適用于對(duì)鮮菜類調(diào)味品中殺菌劑殘留的定性及定量分析，可為鮮菜類調(diào)味品中殺菌劑殘留的持續(xù)監(jiān)測(cè)和完善限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。