藍(lán)莓酒中原花青素提取工藝研究

蔣思峽，王士超，胡鵬剛

（1.茅臺學(xué)院 食品科學(xué)與工程系，貴州 仁懷 564500；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564507；3.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

藍(lán)莓果實中含有大量果膠、微量元素、原花青素等，營養(yǎng)價值較高，可鮮食，也非常適應(yīng)用于制作成保健果酒[1-5]。藍(lán)莓酒按其釀制方法大致可分為發(fā)酵型和配制型。發(fā)酵型藍(lán)莓酒是指完全由藍(lán)莓原果經(jīng)破碎、壓榨取汁，經(jīng)酵母菌酒精發(fā)酵而成。配制型藍(lán)莓酒以發(fā)酵酒或蒸餾酒為酒基，將藍(lán)莓果實或果皮等浸泡其中，或者按一定比例將果汁、香精、色素、甜味輔料等調(diào)配而成，特點是色澤鮮艷，果香好，制做方法簡單，成本低[6-7]。

原花青素（proanthocyanidins，PAs）是一種以黃烷-3-醇作為結(jié)構(gòu)單元，通過C-C鍵聚合而成的多酚類化合物，廣泛存在于自然界多種植物中，尤其藍(lán)莓、葡萄、松樹皮等植物含量較多[8]。據(jù)資料顯示原花青素中的抗氧化性核心成分為低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPC），擁有極強的抗氧化能力，研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)抗氧化、清除自由基能力相當(dāng)于維生素C的20倍、維生素E的50倍[9]。還具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝、抗腫瘤、抑菌抗炎、預(yù)防血液擴張、動脈硬化、抑制α-淀粉酶活性，降低攝入體內(nèi)的葡萄糖吸收率，減輕體質(zhì)量等功效[10-13]。以其穩(wěn)定、無毒、天然等優(yōu)點被廣泛用于食品、醫(yī)藥、保健、日化等方面[14-15]。近年來，原花青素對人體健康潛在生物活性受到廣泛關(guān)注，目前對提取原花青素的研究以葡萄籽、葡萄皮渣、黑枸杞、花生紅衣為原料較多，提取方法有多種，如酶法、溶劑法、超聲輔助法、微波輔助法、超聲波微波聯(lián)用法、超臨界流體萃取法等[16-20]。劉振華等[21]以乙醇為提取劑優(yōu)化黑枸杞中花青素提取工藝時最大提取率為0.424%；張曉靜等[22]利用微波輔助乙醇溶劑提取釀酒葡萄籽中的花青素時最大提取率為5.09%；陳麗媛等[23]在用超聲波提取紫玉米芯中花青素時，最大提取率為4.623 mg/g，研究發(fā)現(xiàn)提取體積分?jǐn)?shù)70%丙酮水溶液為最好溶劑。但在食品工業(yè)中則要求所用溶劑必須無毒且終產(chǎn)物純度高[24]。乙醇提取法設(shè)備要求低，工藝簡單，無毒，故適合于食品工業(yè)。

該研究采用乙醇提取法提取配制型藍(lán)莓酒（以下簡稱藍(lán)莓酒）中原花青素，通過單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取工藝，旨在通過優(yōu)化藍(lán)莓酒中原花青素提取工藝條件，為下一步提高藍(lán)莓酒穩(wěn)定性研究奠定基礎(chǔ)，為推動藍(lán)莓酒的研究及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓酒（12%vol）：市售；鹽酸、甲醇、正丁醇、體積分?jǐn)?shù)為99.5%乙醇（均為分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚（分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；原花青素（色譜級）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204TE分析天平：Mettler toledo國際貿(mào)易有限公司；KW-1000DC電子恒溫水浴鍋：江蘇中大生物科技集團(tuán)有限公司；RE5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海壘固儀器有限公司；TDL-5-A GENESYS 10S紫外分光光度計：美國Thermo公司；CH-250超聲波清洗機：北京創(chuàng)新德超聲電子研究所；TDL-5-A離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；LC-10N-50A真空冷凍干燥機：力辰科技公司；JJ-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素提取工藝優(yōu)化單因素試驗[25]

取一定量藍(lán)莓酒，將石油醚按照藍(lán)莓酒4倍體積加入，室溫浸泡1 d，過濾、抽真空、濃縮，干燥后備用。按照不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、提取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、料液比（1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9（g∶mL））、時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min），對干燥得到的產(chǎn)物進(jìn)行提取，然后再在真空條件下濃縮、洗脫、干燥即得原花青素提取物。初始提取條件：提取溫度50 ℃，時間60 min，料液比1∶8（g∶mL），樣品質(zhì)量1 g。

1.3.2 原花青素含量測定

稱取待測樣品1 mg加入甲醇溶液在棕色容量瓶中定容至10 mL后搖勻，移取稀釋液1 mL，以空白調(diào)零，參照文獻(xiàn)[26]測量吸光度值并計算樣品中原花青素含量。原花青素得率計算公式如下：

其中：w為原花青素得率，mg/g；c為提取液中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；v為提取液體積，mL；m為藍(lán)莓酒樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 原花青素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以藍(lán)莓酒中原花青素得率為評價指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為4個評價因素，采用Box-Behnken中心組合原理，以4因素3水平設(shè)計優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 藍(lán)莓酒中原花青素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for extraction porcess optimization of proanthocyanidins from blueberry wine

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析、方差分析，最終確定藍(lán)莓酒中提取原花青素的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素得率的影響

由圖1可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～70%時，原花青素得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正比，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，原花青素得率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，原花青素得率下降。藍(lán)莓酒中的色素、親脂成分、醇溶雜質(zhì)等溶出量會增加，原花青素與這些物質(zhì)會共同競爭乙醇-水分子，從而降低得率[27]。故原花青素提取最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素得率的影響Fig.1 Effect of different ethanol volume fraction on oligomeric proanthocyanidins yield

2.1.2 料液比對原花青素得率的影響

由圖2可知，料液比在1∶5～1∶7（g∶mL）時，原花青素得率與料液比呈正比，繼續(xù)增加料液比，得率未出現(xiàn)明顯變化?？赡苁且驗樗{(lán)莓酒中原花青素含量相對有限，當(dāng)料液比達(dá)到一定值后，溶液中的原花青素已完全溶解，故得率不再上升。故原花青素提取最佳料液比為1∶7（g∶mL）。

圖2 不同料液比對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of different different material-liquid ratio on oligomeric proanthocyanidins yield

2.1.3 提取時間對原花青素得率的影響

由圖3可知，在提取時間為20～50 min時，原花青素得率與提取時間呈正比，在50 min左右達(dá)到最大值。但繼續(xù)延長提取時間，得率下降，這可能是由于提取時間的延長，原花青素中富含的酚羥基基團(tuán)易與其他物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，從而降低了得率[28]。故原花青素最佳提取時間為50 min。

圖3 不同提取時間對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of different extraction time on oligomeric proanthocyanidins yield

2.1.4 提取溫度對原花青素得率的影響

由圖4可知，在提取溫度為30～50 ℃時，藍(lán)莓酒中原花青素得率隨著提取溫度升高而上升，50 ℃時，得率達(dá)到最大值，繼續(xù)升高溫度，得率反而下降，一方面可能是由于高溫很容易破壞原花青素結(jié)構(gòu)；另一方面可能是由于藍(lán)莓酒中的其他化學(xué)物質(zhì)在高溫條件下，增大了溶出率。故原花青素最佳提取溫度為50 ℃。

圖4 不同提取溫度對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of different extraction temperautre on oligomeric proanthocyanidins yield

2.2 響應(yīng)面試驗分析

以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為4個評價因素設(shè)計響應(yīng)面試驗，藍(lán)莓酒中原花青素提取的響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果分析見表2，二次多項式模型方差分析見表3。

表2 藍(lán)莓酒中原花青素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology for extraction process optimization of proanthocyanidins from blueberry wine

表3 二次多項式模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic polynomial model

續(xù)表

從表2可知，通過Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果分析，建立了多元回歸擬合模型，得到原花青素得率回歸方程：

由表3可知，在本次試驗所涉及的范圍內(nèi)，二次多項回歸模型P＜0.000 1，模型有極顯著差異，說明自變量和響應(yīng)值存在的相關(guān)關(guān)系極顯著。失擬項P=0.747 3＞0.05，說明模型差異顯著，其他因素對該模型影響較小，誤差小，故得出該模型可以很好地反應(yīng)出藍(lán)莓酒中原花青素得率與各因素之間的關(guān)系。從F值可得，四個因素對原花青素得率產(chǎn)生影響的主次排序依次為：提取時間＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比。從方差分析可得知提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素得率影響極顯著（P＜0.01），料液比對其影響不顯著（P＞0.05），提取時間與溫度之間的交互作用極顯著（P＜0.01），乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間之間的交互作用顯著（P＜0.05），乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、料液比與提取時間以及料液比與提取溫度之間的交互作用均不顯著（P＞0.05）。

2.3 響應(yīng)面最優(yōu)結(jié)果與試驗驗證

2.3.1 響應(yīng)面試驗

采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面及等高線圖，探索各因素之間的交互作用對原花青素得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時間交互作用對藍(lán)莓酒中原花青素得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on ethanol concentration,liquid to material ratio,extraction temperature and time on proanthocyanidins yield in blueberry wine

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間之間交互作用顯著（P＜0.05），提取時間與溫度之間交互作用極顯著（P＜0.01）；乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、料液比與提取時間、料液比與提取溫度之間交互作用均不顯著（P＞0.05）。利用響應(yīng)面分析預(yù)測了藍(lán)莓酒中原花青素的最優(yōu)提取工藝條件：提取時間為56.71 min，料液比為1∶7.18（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為66.96%，提取溫度為55.08 ℃，原花青素得率理論值為4.97 mg/g。

2.3.2 驗證試驗

為了驗證模型預(yù)測最優(yōu)工藝條件的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，且便于實際操作，將提取條件修訂為提取時間57 min，料液比為1∶7（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)67.0%，提取溫度55 ℃的條件下進(jìn)行3次重復(fù)平行性試驗，試驗結(jié)果分別為4.83 mg/g、4.74 mg/g、5.01 mg/g，平均原花青素得率實際值為4.86 mg/g。驗證結(jié)果與模型理論值相接近，從而表明該模型可以較好的預(yù)測藍(lán)莓酒中原花青素得率的提取工藝條件。

3 結(jié)論

該研究優(yōu)化藍(lán)莓酒中原花青素的提取工藝，以藍(lán)莓酒中原花青素為目標(biāo)成分，采用乙醇提取法，從單因素試驗得出提取時間、提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)四個因素對藍(lán)莓酒中原花青素得率存在一定影響，以四因素三水平設(shè)計優(yōu)化試驗，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化及驗證試驗確定最優(yōu)提取工藝條件為：提取時間57 min，料液比1∶7（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)67.0%，提取溫度55 ℃，在此最佳條件下，原花青素平均得率為4.86 mg/g。