木棗產(chǎn)香酵母的分離篩選和應(yīng)用

杜亞軍，郭 尚*，李 群，韓基明，于美琴

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能食品研究院，山西 晉中 030031；2.山西省陽高縣果樹站，山西 大同 038100）

木棗（Zizyphus jujubaMill.），別名呂梁木棗，為大棗的一種，主要分布于山西、陜西交界的黃河沿岸地區(qū)，年產(chǎn)2.5億kg以上[1]。木棗缺乏單寧等多酚類物質(zhì)，不如葡萄、蘋果等擁有濃郁的果香，所以釀造的酒無特色，酒體滯重，缺乏酒香。目前的棗酒企業(yè)通常利用商業(yè)酵母，生產(chǎn)的棗酒普遍存在殘?zhí)禽^高，特征香味不明顯、缺少風(fēng)味等共性問題，問題的出現(xiàn)與發(fā)酵菌種有重要關(guān)系。酵母是果酒發(fā)酵的原動力，酵母菌種的發(fā)酵性能直接影響所釀果酒的口感和風(fēng)味[2]，特色果酒專用酵母的篩選、鑒定與培育是果酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的核心問題[3]。香氣是酒類品質(zhì)的重要的評價(jià)指標(biāo)之一，由于產(chǎn)香酵母在果酒發(fā)酵中，對棗酒的風(fēng)味及成分有著重要影響，其代謝及發(fā)酵作用在很大程度上影響果酒的復(fù)雜性[4-6]。

低醇果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%～7%，且口感柔和，風(fēng)味優(yōu)于普通果酒，可減少高酒精度對身體健康的危害，逐漸成為果酒研究的重要趨勢。產(chǎn)香酵母的代謝特征是產(chǎn)乙醇低，正適于發(fā)酵低醇果酒，所以篩選產(chǎn)香酵母，對開發(fā)低醇棗酒產(chǎn)品有實(shí)際意義[7-9]。近年已有產(chǎn)香酵母發(fā)酵低醇果酒的研究[10-13]。目前野生紅棗酵母分離篩選的研究較少，權(quán)英等[14-17]分離篩選過野生紅棗釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），鮮見野生紅棗產(chǎn)香酵母分離篩選的研究報(bào)道。

本研究首先從自然發(fā)酵木棗中分離、篩選產(chǎn)香特性好的酵母，然后根據(jù)棗酒釀造要求，篩選出適宜的產(chǎn)香酵母并應(yīng)用于棗酒發(fā)酵，測定棗酒的理化和感官指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，最后采取分子生物學(xué)方法對酵母進(jìn)行鑒定。有益于解決棗酒生產(chǎn)存在的共性問題，為釀造出香氣豐滿純正、特征香氣明顯，獨(dú)具特色的地域性酒種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、乙醇（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：上海派森諾生物科技有限公司；D4030A型脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTP）、DRR20AM型Taq聚合酶：日本TaKaRa Bio株式會社；瓊脂糖：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，自然pH值，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min；YEPD固體培養(yǎng)基：在YEPD液體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-SG46-280S型壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-100B-Z型生物培養(yǎng)箱、THZ-82型氣浴恒溫振蕩器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Nikon Eclipess E100型生物顯微鏡：日本尼康株式會社；Neofuge 13R型臺式高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；ABI-2720型PCR儀：美國AppliedBiosystems公司；Nano Drop 2000型ND2000：美國Thermo公司；Mini Pro 300V Power Supply型電泳儀：major science公司；Labnet Sub System 70型電泳槽：美國Labnet Inc公司；ABI 3730XL型測序儀：美國Applied Biosystems公司；6890N-5975B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；100 μL PDMS 萃取纖維頭的固相微萃取針：美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)香酵母菌的分離

于山西木棗種植園采集新鮮木棗樣品，整棗用純凈水清洗后，加純凈水自然發(fā)酵，分別于發(fā)酵前期、中期、后期取發(fā)酵液用于酵母菌分離[18]。發(fā)酵液經(jīng)梯度稀釋后，取0.2 mL涂布于YEPD培養(yǎng)基平板，于28 ℃培養(yǎng)48 h，對具有典型酵母菌落特征的單菌落進(jìn)一步劃線分離，經(jīng)鏡檢為純種后分別移種單菌落于YEPD斜面上，冷藏備用。

1.3.2 產(chǎn)香酵母的篩選

一級篩選：產(chǎn)香酵母篩選方法參考劉文麗等[19]采用嗅聞法，即將產(chǎn)香酵母菌種轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)24 h后，將斜面置于鼻孔下方，嗅聞?chuàng)]發(fā)香氣，評價(jià)指標(biāo)為香氣的有無和濃淡等產(chǎn)香效果。

二級篩選：采用棗汁發(fā)酵法，評價(jià)指標(biāo)為酒精度和香氣特征。菌株活化：28 ℃條件下于YEPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16 h；發(fā)酵：28 ℃在200 mL 20°Bx棗汁中發(fā)酵5～35 d；菌液濃度為107～108CFU/mL，接種量體積分?jǐn)?shù)為4%。試驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.3.3 產(chǎn)香酵母發(fā)酵棗酒試驗(yàn)

菌株活化：菌株先在含有20°Bx棗汁的試管中28 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，然后轉(zhuǎn)入含有20°Bx棗汁的三角瓶中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)16 h。發(fā)酵：28 ℃在350 mL 20°Bx棗汁中發(fā)酵5～35 d；菌液濃度為107～108CFU/mL，接種量總體積分?jǐn)?shù)為4%。試驗(yàn)平行重復(fù)3次。分別采用純種發(fā)酵與混菌發(fā)酵的方式：（1）將篩選的產(chǎn)香酵母單獨(dú)發(fā)酵棗汁。（2）將篩選的產(chǎn)香酵母與商業(yè)釀酒酵母按1∶1，進(jìn)行順序接菌，即先接入產(chǎn)香酵母，發(fā)酵2 d后再接入釀酒酵母發(fā)酵棗汁。發(fā)酵完成后，對酒樣進(jìn)行理化分析和感官品評。對照為商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵的棗汁。

1.3.4 棗酒理化指標(biāo)測定及感官評定

酒精度、總糖、總酸等理化指標(biāo)的檢測參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]。感官品評：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中葡萄酒感官評定要求，制定棗酒感官評定標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 棗酒感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of jujube wine

1.3.5 酵母香氣成分的測定[21]

酵母香氣成分的測定采用頂空固相微萃?。╤eadspacesolid phase microextraction，HS-SPME）-氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。前處理方法：稱取適量樣品置于頂空瓶中，加3 mL飽和NaCl溶液密封，于80 ℃條件下平衡30 min，用固相微萃取針萃取30 min，待萃取結(jié)束后，萃取針在進(jìn)樣口解吸5 min。

GC-MS分析條件：HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；分流比：不分流；載氣流速：1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；掃描方式：全掃描；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：180 ℃。升溫程序：起始溫度：45 ℃，保持4 min，以6 ℃/min的速率升至130℃，再以10℃/min的速率升至240℃，保持8min。

定性、定量方法：采集到的質(zhì)譜圖利用美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）譜庫進(jìn)行檢索，定性鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并利用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.3.6 真菌ITS測序鑒定產(chǎn)香酵母

根據(jù)真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒說明書提取酵母菌的DNA，以其為模板，采用引物26sF（5'-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3'）和26sR（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：1.0 μL基因組DNA，5.0 μL 10×Buffer，1.0 μLTaq聚合酶，1.0 μL dNTP，1.5 μL 26sF引物，1.5 μL 26sR引物，39.0 μL雙蒸水（ddH2O），總體積50.0 μL[22]。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取各個菌種純化后的PCR產(chǎn)物，使用測序儀ABI3730-XL進(jìn)行DNA測序。用美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）將拼接后的序列文件進(jìn)行同源性比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息，采用MEGA6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 木棗野生產(chǎn)香酵母菌株的分離

酵母群的種類與地理氣候條件有關(guān)，每年都有微小的變化[23]。本試驗(yàn)從木棗發(fā)酵液中共分離出232株產(chǎn)香酵母菌株，編號為Z1～Z232，依據(jù)菌株菌落和細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，將菌株分為3類。產(chǎn)香酵母菌株的分離結(jié)果見表2，菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖1。

表2 產(chǎn)香酵母菌株的分離結(jié)果Table 2 Isolation results of aroma-producing yeast strains

圖1 三類產(chǎn)香酵母菌菌株的菌落（a）和細(xì)胞形態(tài)（b）Fig.1 Colonial (a) and cell (b) morphology of three aroma-producing yeast strains

由表2及圖1可知，分離的232個菌株屬于三類不同的產(chǎn)香酵母，它們在菌落、細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及出芽方式上不同。

2.2 產(chǎn)香酵母一級篩選

對保存的232株產(chǎn)香酵母菌株通過嗅聞斜面香氣，鑒別菌株有無產(chǎn)香現(xiàn)象并比較香氣的濃淡，結(jié)果如表3所示。

表3 產(chǎn)香酵母菌株產(chǎn)香試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of aroma-producing tests of aroma-producing yeast strains

由表3可知，產(chǎn)香效果較好的菌株有18株，菌株產(chǎn)香，香氣較濃的菌株有11株，香氣較淡的有7株，將這18株菌株進(jìn)行二級篩選試驗(yàn)。

2.3 產(chǎn)香酵母二級篩選

對18株產(chǎn)香酵母菌株進(jìn)行棗汁發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 產(chǎn)香酵母菌株發(fā)酵棗汁結(jié)果Table 4 Results of jujube juice fermentation by aroma-producing yeast strains

產(chǎn)香酵母通過對棗汁發(fā)酵，產(chǎn)香特征較好的酵母菌株有Z1、Z2、Z5、Z12、Z29、Z228，其中產(chǎn)香特性最好的是菌株Z228。菌株Z188和Z191因在發(fā)酵棗汁時不產(chǎn)氣，沒有香味僅有酸味，未能完成發(fā)酵。發(fā)酵樣品的酒精度均在4%vol～7%vol之間，不同樣品酒精度相差不大，但是菌株Z228發(fā)酵棗酒香氣較濃，所以篩選菌株Z228進(jìn)行棗酒發(fā)酵試驗(yàn)。

2.4 產(chǎn)香酵母發(fā)酵棗酒試驗(yàn)

將產(chǎn)香酵母Z228單獨(dú)或與釀酒酵母（1∶1）協(xié)同發(fā)酵棗汁，對照為商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵的棗汁。發(fā)酵完成后測定棗汁發(fā)酵液理化指標(biāo)同時進(jìn)行感官品評，結(jié)果如表5、表6所示。

表5 不同菌種發(fā)酵棗汁理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 5 Determination results of physical and chemical indexes of fermented jujube juice by different strains

表6 不同菌種發(fā)酵棗汁感官評定結(jié)果Table 6 Sensory evaluation results of fermented jujube juice by different strains

釀酒酵母起酵快，但發(fā)酵穩(wěn)定性差，持續(xù)時間短，5 d后即中止發(fā)酵，會導(dǎo)致棗酒殘?zhí)禽^高。產(chǎn)香酵母起酵慢，但發(fā)酵穩(wěn)定，持續(xù)時間長，至少30 d后中止發(fā)酵，能充分發(fā)酵棗汁，并且能為棗酒提供豐富的香味成分。由表5及表6可知，釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵棗汁，酒精度較高，為10.2%vol，殘?zhí)瞧?，?.7 g/L，香氣較淡，口感、風(fēng)格一般；產(chǎn)香酵母單獨(dú)發(fā)酵棗汁，酒精度低，為6.2%vol，殘?zhí)歉哌_(dá)75.3 g/L，營養(yǎng)成分多，酸度低，為1.6 g/L，香氣濃，花香，口感略甜，柔和，酸苦味淡，風(fēng)格明顯，符合低醇果酒要求；產(chǎn)香酵母與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵棗汁，酒精度提高到13.3%vol，殘?zhí)墙档?.6%vol，花香清香明顯、協(xié)調(diào)，酒體豐滿，苦味得以淡化。結(jié)果表明，協(xié)同發(fā)酵既能提高棗酒酒精度，降低殘?zhí)?，又使棗酒擁有更加?fù)雜的花香與果香氣，原有苦味減弱，產(chǎn)品特色風(fēng)格明顯。產(chǎn)香酵母發(fā)酵時產(chǎn)酒精能力弱，但可消耗一部分糖，混菌發(fā)酵能明顯提高酒樣中花香和果香[24-26]。產(chǎn)香酵母產(chǎn)總酸比釀酒酵母和混菌發(fā)酵低，具備一定的降酸能力，這與劉小雨等[27]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5 產(chǎn)香酵母香氣成分的測定

菌株Z228和對照釀酒酵母發(fā)酵棗汁的揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖見圖2，香氣成分及含量分別見表7、表8。

圖2 菌株Z228（A）及釀酒酵母（B）發(fā)酵棗汁中香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ions chromatogram of aroma components in fermented jujube juice by strain Z228 (A) and Saccharomyces cerevisiae(B) analysis by GC-MS

表7 菌株Z228發(fā)酵棗汁中香氣成分測定結(jié)果Table 7 Determination results aroma components in fermented jujube juice by strain Z228

續(xù)表

表8 釀酒酵母發(fā)酵棗汁中香氣成分測定結(jié)果Table 8 Determination results of aroma components in fermented jujube juice by Saccharomyces cerevisiae

續(xù)表

由表7、表8可見，菌株Z228發(fā)酵棗汁中共測得46種主要香氣成分：香氣成分主要為醇類、酸類和酚類，主要為異戊醇（15.64%）、6-羥基煙酸（6.75%）、苯乙醇（2.47%），異戊醇（2.26%），4-乙基苯酚（1.10%）、4-乙基-2-甲氧基-苯酚（1.10%）等。其中乙醇含量極高，酯類含量很低，這和一般產(chǎn)酯較高的產(chǎn)香酵母不同。乙醇具有特殊香味，是合成乙酯的前體；6-羥基煙酸具有協(xié)調(diào)香氣作用；苯乙醇具有柔和、愉快和持久的玫瑰香氣，異戊醇具有蘋果白蘭地香氣，苯乙醇、異戊醇等高級醇還能襯托酯香，使酒香更完美；4-乙基苯酚呈強(qiáng)烈木-酚氣息，有輕微香甜氣息；4-乙基-2-甲氧基-苯酚呈強(qiáng)烈香辛料、丁香和發(fā)酵似香氣，有炒花生氣息。

對照釀酒酵母發(fā)酵棗汁中共測得33種主要香氣成分：辛酸乙酯（20.45%）、異戊醇（15.64%）、癸酸乙酯（15.41%）、乙酸-3-甲基丁酯（9.38%）、乙醇（9.11%）、己酸乙酯（7.95%）、乙酸乙酯（2.72%）、月桂酸乙酯（2.34%）、乙醛縮二乙醇（2.17%）、2-（氨基氧基）乙酸（1.82%）、苯乙醇（1.11%）、2,3-丁二醇（1.04%）等。香氣成分主要為高級醇類、酸類和酯類，其中酯類含量較高。菌株Z228和釀酒酵母發(fā)酵棗汁香氣成分區(qū)別較大，二者協(xié)同發(fā)酵，達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)，并且能有效利用酸類和醇類合成更多酯類，使酒體豐滿，香氣復(fù)雜而有層次感。

2.6 產(chǎn)香酵母菌株的鑒定

依據(jù)菌落和細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，產(chǎn)香酵母菌株Z228初步鑒定為第二類（見表2），采用真菌ITS測序方法將產(chǎn)香酵母進(jìn)一步鑒定，結(jié)果見圖3。由圖3可知，通過比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，產(chǎn)香酵母菌株Z228與季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）的序列同源性最高，相似度達(dá)到99.65%。與季也蒙畢赤酵母的親緣關(guān)系最近，所以鑒定菌株Z228為季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）。

圖3 基于ITS基因序列酵母菌株Z228的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast strain Z228 based on ITS gene sequences

3 結(jié)論

山西木棗種植園采集的木棗經(jīng)自然發(fā)酵，從不同時期共分離出三類共232株產(chǎn)香酵母菌株，一級篩選采用嗅聞法篩選出產(chǎn)香效果較好的菌株有18株，二級篩選采用棗汁發(fā)酵法篩選出產(chǎn)香特性最好的菌株Z228，測定了菌株香氣成分。將產(chǎn)香酵母Z228單獨(dú)或與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵棗汁，結(jié)果表明產(chǎn)香酵母單獨(dú)發(fā)酵棗汁，酒精度低，殘?zhí)歉?，酸度低，香氣濃；協(xié)同發(fā)酵既能提高酒精度，降低殘?zhí)?，又能使產(chǎn)品擁有更加復(fù)雜的花香與果香氣味，原有苦味減弱，產(chǎn)品極具風(fēng)味特色。最后通過分子生物學(xué)鑒定菌株Z228為季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）。