基于TGF-β1、EGF、TNF-α水平研究吉西他濱對(duì)膀胱炎模型大鼠灌注的作用

王潘紅 鄭明 蔡云峰

腺性膀胱炎在臨床上是一種特殊且較為少見的膀胱黏膜增生性病變，以前認(rèn)為其發(fā)病率在0.1%～1.9%，但隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，膀胱鏡的廣泛使用，使診斷率有所提高，腺性膀胱炎的發(fā)病率有上升的趨勢(shì)[1]。腺性膀胱炎部分分型有癌變傾向，會(huì)逐漸演變發(fā)展成為膀胱多種惡性腫瘤[2]。目前，臨床上多采用經(jīng)尿道電切術(shù)的干預(yù)手段對(duì)患者進(jìn)行治療，再配合化療藥物進(jìn)行膀胱灌注。但由于化療對(duì)機(jī)體組織有諸多不良反應(yīng)，給患者及其家庭的生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重不良影響。本次研究旨在研究TGF-β1、EGF、TNF-α 在吉西他濱灌注治療腺性膀胱炎中的作用，為臨床研究提供一定的參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 2020 年5 月至2020 年11 月期間，衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院選擇30 只SD 雌性大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，大鼠2～3 月齡，體重220～240 g，采用12 h 恒定晝夜交替光照，相對(duì)濕度為50%～70%，溫度為22 ℃～26 ℃的飼養(yǎng)條件，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將30 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組：吉西他濱組、模型組、對(duì)照組，每組10 只。三組大鼠均自由飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 建立腺性膀胱炎大鼠模型 參照蔡蔚等[3]方法，對(duì)吉西他濱組和模型組共計(jì)20 只大鼠建立腺性膀胱炎模型。腺性膀胱炎模型建立方法為：20 只大鼠通過采用25%烏拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位將大鼠固定，常規(guī)消毒尿道口及四周。用外導(dǎo)管經(jīng)尿道后壁插入尿道，將大鼠殘余尿液排盡后用注射器注入0.2 ml 的DH5α 大腸桿菌溶液（108～9CFU/100 Ul），每間隔1 d，對(duì)兩組大鼠進(jìn)行一次灌注，一共進(jìn)行20 次。50 d后成功建立腺性膀胱炎大鼠模型。對(duì)照組大鼠10 只大鼠采用同樣的操作方法，對(duì)其膀胱灌注等量的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2 灌注給藥 吉西他濱組大鼠以1.2.1 的灌注方式對(duì)10 只給予吉西他濱（150 mg/kg）灌注，每周對(duì)大鼠進(jìn)行一次灌注，6 周后改為每2 周進(jìn)行一次，共計(jì)8 次。模型組和對(duì)照組大鼠采用同樣方式，對(duì)其膀胱灌注等量0.9%氯化鈉注射液。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 參照李文標(biāo)等[4]的方法，對(duì)三組大鼠進(jìn)行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。在用烏拉坦麻醉后，仰臥位將大鼠固定，用外導(dǎo)管插入膀胱，通過三通閥使外導(dǎo)管與壓力感受器和微量灌注泵連接，將大鼠殘余尿液排盡后，向膀胱以0.1 ml/min 緩慢灌注常溫0.9%氯化鈉注射液。記錄三組大鼠最大膀胱測(cè)壓容積、排尿間隔、膀胱順應(yīng)性等數(shù)據(jù)。

1.3.2 RT-PCR 檢測(cè)TGF-β1、EGF、TNF-α 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 在完成尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后將大鼠處死，收集大鼠膀胱組織。取每只大鼠半個(gè)膀胱制成勻漿，用于檢測(cè)TGF-β1、EGF、TNF-α 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。按RT-PCR 試劑盒從肝臟中提取總RNA，再以此為模板合成cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行RT-PCR，通過觀察循環(huán)數(shù)（Ct）值，計(jì)算2-ΔΔCt值進(jìn)行靶基因細(xì)胞因子定量分析。引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 目的基因TGF-β1、EGF和TNF-α擴(kuò)增引物序列

1.3.3 免疫蛋白印跡法檢測(cè)TGF-β1、EGF、TNF-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取余下半個(gè)膀胱制成勻漿，采用免疫蛋白印跡法檢測(cè)膀胱組織勻漿的TGF-β1、EGF、TNF-α水平。膀胱組織勻漿加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，并采用二喹啉甲酸法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，取30 μg 待測(cè)樣本蛋白進(jìn)行Westen blot 檢測(cè)。具體操作方法如下：在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，把凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（0.22 μm，轉(zhuǎn)膜電流0.2A）上，加入5%脫脂奶粉封閉2 h 后加入工作濃度1∶1000 的TGF-β1、EGF、TNF-α抗體后在4 ℃冰箱孵育過夜。再用磷酸緩沖鹽溶液漂洗3 次后，加入相應(yīng)的二抗孵育2 h 后，即可在暗室中X 線曝光、顯影，利用Quality One 對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)度分析，以β-actin 為內(nèi)參計(jì)算樣本蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，方差齊的多組間比較均采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢 測(cè)TGF-β1、EGF、TNF-α 基 因mRNA的相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果見表2

表2 三組大鼠TGF-β1、EGF、TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

由表2 可見，三組大鼠的TGF-β1、EGF、TNF-α基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=22.94、22.59、30.32，P均＜0.05）。吉西他濱組和模型組大鼠的TGF-β1、EGF、TNF-α 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=2.93、3.34、3.52；6.72、6.71、5.81，P均＜0.05）。與模型組比較，吉西他濱組大鼠的TGF-β1、EGF 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量較高，TNF-α 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=3.64、3.19、2.08，P均＜0.05）。

2.2 免疫蛋白印跡法檢測(cè)TGF-β1、EGF、TNF-α 蛋白的相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果見圖1和見表3

圖1 三組大鼠TGF-β1、EGF、TNF-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量

由表3 可見，三組大鼠的TGF-β1、EGF、TNF-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=39.21、67.53、56.69，P均＜0.05）。吉西他濱組和模型組大鼠的TGF-β1、EGF、TNF-α 蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=8.76、5.81、4.65；8.76、11.61、1.70，P均＜0.05）。與模型組比較，吉西他濱組大鼠的TGF-β1、EGF 蛋白的相對(duì)表達(dá)量較高，TNF-α 蛋白的相對(duì)表達(dá)量較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=2.80、5.80、2.79，P均＜0.05）。

表3 三組大鼠TGF-β1、EGF、TNF-α 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 三組大鼠尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表4

表4 三組大鼠尿動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

由表4 可見，三組大鼠的最大膀胱測(cè)壓容積、排尿間隔、膀胱順應(yīng)性指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=40.06、50.51、28.13，P均＜0.05）。吉西他濱組和模型組大鼠的最大膀胱測(cè)壓容積、排尿間隔、膀胱順應(yīng)性低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=8.34、9.91、7.90；1.76、3.93、3.49，P均＜0.05）。吉西他濱組大鼠的最大膀胱測(cè)壓容積、排尿間隔、膀胱順應(yīng)性高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=6.20、5.32、6.32，P均＜0.05）。

3 結(jié)論

腺性膀胱炎是一種多發(fā)于女性的膀胱黏膜病變，目前有關(guān)腺性膀胱炎的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，但其病因可能與下尿路感染、下尿路梗阻/異常和膀胱息肉等其他因素長期慢性的刺激有關(guān)。在刺激因素的影響下移行上皮逐步形成上皮芽、上皮巢穴，最后再發(fā)展成為腺性膀胱炎[5]。腺性膀胱炎臨床表現(xiàn)有多種分型，但臨床癥狀缺乏特異性。

TNF-α 在臨床中常作為炎癥標(biāo)志物用于判斷機(jī)體組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)，TNF-α 具有廣泛的生物活性，能夠通過誘導(dǎo)其他的細(xì)胞因子，進(jìn)而使得炎癥細(xì)胞聚積，引起炎癥反應(yīng)。已有研究表明，TNF-α 在腺性膀胱炎的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[6]。本次研究通過RT-PCR 和免疫蛋白印跡法的檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠比較，吉西他濱組與模型組大鼠TNF-α mRNA 及其蛋白均有所升高，這一結(jié)果與周黎強(qiáng)等[7]結(jié)果吻合，且吉西他濱組大鼠TNF-α mRNA 及其蛋白低于模型組（P均＜0.05）。提示TNF-α參與了腺性膀胱炎的發(fā)展過程，并且吉西他濱能夠降低腺性膀胱炎大鼠膀胱組織內(nèi)TNF-α 的表達(dá)。TGF-β1 是TGF 家族成員之一，其廣泛存在于機(jī)體各個(gè)組織中，在細(xì)胞生長、分化中扮演著重要的角色。TNF-α 作為炎癥因子，能夠刺激TGF-β1 的分泌，對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，具有一定的抗炎作用[8]。申旭霽等[9]研究認(rèn)為，TGF-β1 可以誘導(dǎo)膀胱上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，對(duì)炎癥組織的修復(fù)有重要的意義。EGF 對(duì)于細(xì)胞的增殖、分裂有著重要的作用，能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)皮膚、腎等組織損傷部分的修復(fù)愈合，具有廣泛的生物學(xué)意義[10]。本次研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠比較，吉西他濱組與模型組大鼠TGF-β1 和EGF mRNA 及其蛋白均有所升高，且吉西他濱組大鼠TGF-β1 和EGF mRNA 及其蛋白高于模型組（P均＜0.05），均提示了TGF-β1 和EGF 參與了腺性膀胱炎的發(fā)展[11]，通過對(duì)大鼠膀胱灌注吉西他濱能夠促進(jìn)TGF-β1 和EGF 在膀胱組織內(nèi)的表達(dá)。

膀胱炎患者普遍存在下尿路排尿困難的問題，因此可以通過尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)評(píng)估膀胱炎進(jìn)展過程。本次研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠比較，吉西他濱組和模型組大鼠的最大膀胱測(cè)壓容積、排尿間隔、膀胱順應(yīng)性均有所降低，且吉西他濱組最大膀胱測(cè)壓容積、排尿間隔、膀胱順應(yīng)性均高于模型組大鼠（P均＜0.05）。結(jié)果表明隨著吉西他濱組大鼠膀胱組織內(nèi)炎癥因子TNF-α 的降低和TGF-β1 和EGF 的升高，其最大膀胱測(cè)壓容積、排尿間隔、膀胱順應(yīng)性均有明顯的改善，表明吉西他濱對(duì)于腺性膀胱炎有一定的治療效果。

綜上所述，膀胱灌注吉西他濱在一定程度上能夠起到治療大鼠腺性膀胱炎的效果，減少TNF-α 的表達(dá)，促進(jìn)TGF-β1、EGF 的表達(dá)。本次研究為腺性膀胱炎的臨床研究提供一定的參考，提示了灌注吉西他濱治療腺性膀胱炎可能是與TGF-β1、EGF 和TNF-α 有關(guān)。本次研究也有一定的局限性，實(shí)驗(yàn)的樣本過少，對(duì)結(jié)果可能產(chǎn)生一定的偏倚。結(jié)論尚需多中心、大樣本量研究進(jìn)一步確定與證實(shí)。