白楊素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路發(fā)揮抗炎和抗氧化作用：基于蛋白質芯片方法

蔡蘇娜，李 強，3，周 慧，許雨墨，宋 靜，甘 超，戚之琳1，，齊世美1，

皖南醫(yī)學院1生物化學與分子生物學教研室，2活性大分子重點實驗室，3人體解剖學教研室，安徽 蕪湖241002

多種疾病伴隨著顯著的炎癥反應，涉及免疫系統(tǒng)中不同類型的細胞和信號傳導途徑，例如靜脈和慢性動脈疾?。?］，心肌缺血［2］，阿茲海默癥，急性腦卒中［3］，癌癥和動脈高血壓［4］等。PI3K信號通路通過調節(jié)多條關鍵性炎癥通路和白細胞功能來促進炎癥的發(fā)展［5］。用PI3Kδ特異性抑制劑GS-9829處理MRL/lpr小鼠，可以降低血清IL-6和TNF-α水平，減少腎臟中巨噬細胞浸潤［6］。IP-145，PI3Kδ/γ雙重抑制劑，在OVA誘導的哮喘中，能夠減少嗜酸性中性粒細胞的浸潤［7］。ZSTK474是新型的泛PI3K抑制劑，能夠減少自身免疫性腦脊髓炎和類風濕關節(jié)炎小鼠模型中的炎癥反應［8-9］。臨床試驗結果顯示，ZSTK474能夠引起高血糖，胃腸道功能紊亂和精神病學影響［10-11］。因此，深入探討PI3K/AKT/mTOR信號通路在炎癥發(fā)生中的分子機制，篩選靶向性高，副作用小的化合物，作為臨床炎癥和相關性疾病的候選藥物，具有巨大的應用價值。

糖尿病誘發(fā)的氧化應激能夠增加促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）的水平，上調諸如血管粘附分子-1（VCAM-1），細胞間粘附分子-1（ICAM-1）和核因子-κB（NF-κB）等炎性分子的表達［12］。而且，ROS可以通過直接激活PI3K，同時使PIP3負調節(jié)分子PTEN失活，增強AKT功能。另外，ROS在較低水平能夠直接氧化AKT分子中的二硫鍵，導致AKT和磷酸酶2A（PP2A）的解離，使AKT產生短期激活效應［13］。我們課題組證實在神經細胞模型PC12細胞中，下調H2O2誘導的ROS水平后，AKT活性降低，炎癥反應減少［14］。但是ROS在炎癥反應中的具體產生機制，在炎癥相關信號通路PI3K/AKT/mTOR中扮演的角色，目前尚未完全闡明。

白楊素（Chrysin）又名白楊黃素，5，7-二羥基黃酮，屬于黃酮類化合物。在以炎癥為特征的骨關節(jié)炎中，白楊素通過阻斷NF-κB通路，抑制IL-1β誘導的炎癥因子NO和PGE2的產生［15-16］。我們課題組也證實，白楊素能夠通過調控MAPKs和JAK/STAT信號通路，抑制炎癥反應［17-18］。在淋巴細胞性白血病細胞中，白楊素通過增加細胞內ROS水平，抑制細胞增殖［19］。但是，我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，白楊素能夠降低炎癥反應中ROS的生成。因此，在本研究中，我們擬用脂多糖刺激小鼠腹腔巨噬細胞系，建立細胞炎癥模型，確定白楊素的抗炎作用。在此基礎上，我們試圖進一步檢測白楊素對ROS的影響，用蛋白質芯片篩選相關炎癥信號通路，并探索ROS在炎癥發(fā)生中的作用，為闡明白楊素的抗炎分子機制提供理論依據(jù)，為拓寬白楊素在炎癥和炎癥相關疾病中的用藥范圍，提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7購自于中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫，青霉素-鏈霉素雙抗，DMEM完全培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone)，白楊素（阿拉丁生物試劑公司，上海），脂多糖（Sigma），CCK-8細胞活力/毒性試劑盒（Dojindo，上海），Trizol試劑，逆轉錄酶試劑盒和預染蛋白Marker Page Ruler Prestained Protein Ladder（Thermo），ELISA 檢測試劑盒（R&D Systems），DCFH-DA探針（碧云天，上海），iNOS，COX-2，p-AKT（Ser473），AKT，p-mTOR（Thr2448），mTOR，p-PRAS40（Thr246），p-P70S6K（Thr389），p-S6RP（Ser235/236），S6RP抗體和PathScan?Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit（Cell signaling technology），綠色熒光蛋白標記鼠抗兔二抗和紅色熒光蛋白標記羊抗兔二抗（LI-COR）。

1.2 主要儀器

細胞培養(yǎng)箱（Thermo）；蛋白電泳、轉膜系統(tǒng)（Bio-Rad）；DNM-9602 酶標分析儀（普朗新技術有限公司，北京）；熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS）；NanoDrop 2000微量紫外-可見光分光光度計（Thermo Fisher Scientifi）LI-COR Odyssey Infrared 成像系統(tǒng)（OLYMPUS）；全自動免染凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.3 細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞復蘇后用含1%青霉素-鏈霉素雙抗，10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 CCK-8法檢測細胞活力

將RAW264.7細胞以約1×104細胞/孔的密度接種于96 孔板，分別加入白楊素（0、5、10、15、30、60、120、240 μg/mL），藥物處理24 h后，每孔加入100 μL CCK-8稀釋液（用DMEM完全培養(yǎng)基按照1：10比例稀釋），培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，振蕩10 min，全波長酶標儀檢測吸光度A450nm，計算細胞增殖率。

1.5 Western blot檢測蛋白表達量

根據(jù)實驗方案，用白楊素和脂多糖單獨或聯(lián)合處理RAW264.7細胞后，棄去細胞培養(yǎng)液，使用4 ℃PBS清洗3遍，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min,提取各組細胞總蛋白。BCA法測定樣品蛋白濃度，取等量蛋白樣品，12%SDS-PAGE電泳分離，轉膜，封閉后，用相應的蛋白一抗4 ℃振搖過夜，加入熒光二抗，室溫避光振搖1 h，用LI-COR Odyssey Infrared成像系統(tǒng)掃描成像。

1.6 蛋白質芯片篩選信號通路

取對數(shù)生長期RAW264.7細胞，按照1×107的密度接種于12孔板，用或不用60 μg/mL的白楊素預處理細胞2 h，加入100 ng/mL脂多糖分別刺激0、10、30 min，1、2、4、8、16 h，棄去細胞培養(yǎng)液，用4 ℃PBS清洗1遍。按照PathScan?Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit說明書配置試劑，按步驟處理細胞，在避光條件下，使用LI-COR Odyssey Infrared成像系統(tǒng)掃描灰度值。

1.7 RT-PCR檢測mRNA表達量

將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，按照2×107的密度接種于6孔板，分為空白對照組，白楊素（60 μg/mL）單獨處理組，脂多糖（100 ng/mL）單獨刺激組，以及白楊素（60 μg/mL）和脂多糖（100 ng/mL）聯(lián)合處理組。白楊素預處理2 h后，加入脂多糖刺激18 h，采用Trizol一步法提取各組細胞總mRNA，使用Revert Aid?M-MLV逆轉錄酶試劑盒逆轉錄合成cDNA。iNOS，COX-2和GAPDH引物由金斯瑞公司設計合成，引物序列如下：iNOS上游引物5'-GGGTCTTGTTCACTCCACGG-3'，下游引物5'-GCTGAGAACAGCACAAGGGG-3'；COX-2 上游引物5'-CTGACCCCCAAGGCTCAAAT-3'，下游引物5'-GGGGATACACCTCTCCACCA-3'；GAPDH上游引物5'-GGAGAGTGTTTCCTCGTCCC-3'，下游引物5'-ACTGTGCCGTTGAATTTGCC-3'。配置反應體系，經94 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，72 ℃5 min，30次循環(huán)，進行PCR擴增。

1.8 ELISA檢測細胞因子濃度

RAW264.7細胞按照實驗方案進行分組，用白楊素（10、30、60 μg/mL）孵育細胞2 h 后，加入脂多糖（100 ng/mL）刺激18 h，收集細胞培養(yǎng)液，4 ℃13 000 r/min離心15 min，留取上清，嚴格按照ELISA試劑盒的操作步驟，處理樣品。最后，避光條件下，酶標儀檢測吸光度A450nm，計算細胞因子釋放量。

1.9 Griess法檢測NO濃度

細胞處理方法同ELISA法，留取上清備用。按照說明書處理樣品和標準品，依次加入試劑A，試劑B，混勻，靜置，離心后取上清，加入顯色劑，15 min后在酶標儀下，檢測吸光度A550nm。

1.10 DCFH-DA熒光探針法檢測ROS水平

將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，按照1×107的密度接種于12孔板，貼壁后，每孔加入1 mL終濃度為50μL/mL的DCFH-DA探針，避光孵育1 h。按照實驗方案，分別用白楊素（10、30、60 μg/mL），N-乙酰-半胱氨酸(NAC)（20 μmol/L）和脂多糖（100 ng/mL）處理細胞后，用無血清培養(yǎng)基避光清洗3次，去除游離的DCFH-DA探針，熒光倒置顯微鏡（Olympus）下觀察細胞內熒光強度，并拍照（100×）記錄。

1.11 統(tǒng)計學分析

采用Graph Pad Prism 6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白楊素對炎癥相關細胞因子和炎癥介質生成的作用

ELISA 和Griess 法結果顯示，脂多糖刺激RAW264.7 細胞后，細胞內的IL-6，MCP-1，TNF-α和NO的生成和釋放量顯著增加，而白楊素可以劑量依賴性地抑制其合成和分泌（P<0.01，圖1）。Western blot和RT-PCR結果證實，白楊素亦可以顯著下調脂多糖刺激引起的iNOS蛋白和mRNA水平的升高，對COX-2的蛋白和mRNA的抑制相對較弱（P<0.01，圖2）。

圖1 白楊素對脂多糖誘導的炎癥因子和炎癥介質合成和釋放的影響Fig.1 Effect of chrysin on the production and release of inflammatory cytokines and inflammatory mediators.A:IL-6;B:MCP-1;C:TNF-α;D:NO.(n=3),*P<0.05,**P<0.01 vs LPS(100 ng/mL group).

圖2 白楊素對脂多糖誘導的iNOS和COX-2 mRNA含量和蛋白水平的影響Fig.2 Effect of chrysin on mRNA and protein levels of iNOS and COX-2 induced by LPS.A:iNOS and COX-2 mRNA levels;B:iNOS and COX-2 protein levels.(n=3),*P<0.05,**P<0.01 vs LPS(100 ng/mL group).

2.2 白楊素對RAW264.7細胞活力的影響

我們采用CCK-8法檢測細胞活力值，發(fā)現(xiàn)Control組的細胞活力平均為95.1%，120 μg/mL組和240 μg/mL組的細胞活力分別為87%和69%，而白楊素劑量在60 μg/mL內，對細胞活力基本無影響（圖3）。結合白楊素發(fā)揮抗炎作用的用藥劑量，我們分別選擇10、30、60 μg/mL作為后續(xù)實驗的低、中、高劑量組。

圖3 白楊素對RAW264.7細胞存活率的影響Fig.3 Effect of chrysin on survival rate of RAW264.7 cells(n=5).*P<0.05,**P<0.01 vs chrysin(0 μg/mL group).

2.3 蛋白質芯片篩選炎癥信號分子

蛋白質芯片篩選結果提示：脂多糖刺激導致p-AKT（Thr308），p-AKT（Ser473），p-S6RP（Ser235/236），p-mTOR（Ser2448），p-HSP27（Ser78），p-P70S6K（Thr389），p-PRAS40（Thr246）在不同時間點磷酸化激活，而白楊素處理后，在0～16 h的作用時間范圍內，對以上信號分子的活化均有抑制作用，尤其以AKT，核糖體40S蛋白S6（S6RP），PRAS40在脂多糖和白楊素處理前后磷酸化變化最顯著（圖4）。

圖4 蛋白質芯片初步篩選炎癥相關信號分子Fig.4 Preliminary screening of inflammation-related signal molecules through protein chips.A:Protein chip fluorescence detection chart;B:Grayscale image of protein chip;C:Protein chip volcano analysis chart.

2.4 白楊素對AKT/mTOR信號通路的調控

Western blot檢測結果表明，p-AKT（Ser473），p-mTOR（Ser2448）和p-70S6K（Thr389）位點磷酸化從0.5 h開始增加，4 h開始下降。p-PRAS40（Thr246）從1 h開始活化，一直持續(xù)到4 h。p-S6RP（Ser235/236）從2 h開始磷酸化，2.5 h達到最高峰，4 h回歸到本底水平（圖5）。當用脂多糖刺激2 h后，再用不同濃度的白楊素進行處理，發(fā)現(xiàn)10 μg/mL組白楊素對脂多糖激活的信號分子就有抑制作用，60 μg/mL 組達到最大抑制效果。Western blot結果和蛋白芯片篩選結果一致。

圖5 白楊素對脂多糖誘導的AKT/mTOR信號通路的影響Fig.5 Effect of chrysin on AKT/mTOR signal pathway in cells stimulated by LPS.A:LPS activates AKT/mTOR signaling molecules at different time points;(n=3),*P<0.05,**P<0.01 vs LPS(100 ng/mL 0 h group).B:Different concentrations of chrysin inhibit LPS-induced activation of AKT/mTOR signaling molecule,n=3,*P<0.05,**P<0.01 vs LPS(100 ng/mL group).

2.5 白楊素對活性氧ROS生成的影響

我們運用DCFH-DA熒光探針法檢測細胞內活性氧ROS的生成情況。在Control組和白楊素單處理組中，僅見數(shù)個微弱的綠色熒光點，在未受刺激的RAW264.7細胞中，ROS的本底生成量很低。用脂多糖刺激0.5 h后，細胞內綠色熒光點數(shù)量顯著增加，并出現(xiàn)高亮熒光點。用不同濃度的白楊素處理后，雖然綠色熒光點數(shù)量沒有顯著減少，但是熒光強度明顯下降（圖6）。

2.6 活性氧ROS參與炎癥反應的調控

我們運用ROS清除劑NAC處理細胞后，發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激產生的內源性ROS，基本被清除，細胞內ROS水平接近對照組的本底水平（圖6）。NAC單獨處理對信號分子沒有影響，但是對LPS激活的信號分子的磷酸化水平升高均有顯著的抑制作用（P<0.05，圖7）。

圖6 白楊素對脂多糖激發(fā)的內源性ROS生成的影響Fig.6 Effect of chrysin on the generation of endogenous ROS in LPS-stimulated cells.

圖7 NAC對炎癥介質和AKT/mTOR通路的調控作用Fig.7 Regulation of NAC on inflammatory mediators and AKT/mTOR pathway.A:Effect of NAC on iNOS and COX-2 protein expression.B:NAC regulates the activation of AKT/mTOR signaling molecules (n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs LPS (100 ng/mL group).

3 討論

當受到外源物質刺激時，巨噬細胞通過誘導促炎細胞因子（例如TNF-α，IL-6和IL-1β）的表達，參與并促進免疫應答［19］。小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系RAW264.7細胞源自Abelson鼠科白血病病毒誘導的腫瘤，具有良好的巨噬細胞特性，分化程度高，易于觀察，是目前公認的體外巨噬細胞模型之一。在本研究中，我們用革蘭氏陰性菌細胞外壁脂多糖刺激RAW264.7細胞，建立體外炎癥模型。我們發(fā)現(xiàn)，脂多糖能夠誘導RAW264.7細胞內促炎細胞因子IL-6，MCP-1和TNFα，以及炎癥介質NO的合成和分泌。另外，誘導型NO合酶（iNOS）的mRNA含量和蛋白濃度也顯著升高，環(huán)氧合酶-2（COX-2）的變化相對較?。▓D2）。因此，脂多糖能夠誘導RAW264.7細胞內炎癥反應的發(fā)生，體外炎癥模型建立成功。

白楊素是新藥開發(fā)研究中一個非常重要的資源［20-21］。白楊素通過抑制NF-κB信號傳遞和過氧化物酶增殖物激活受體γ活化，下調IL-1β,IFN-γ，IL-6等細胞因子，減少免疫炎癥反應。另外，對炎癥介質合成酶類，如COX-2，MPO，iNOS和磷脂酶A2亦有抑制作用［22-23］。我們課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)白楊素能夠抑制JAK/STAT和MAPKs信號通路，發(fā)揮抗炎作用。為了全面剖析白楊素的抗炎分子機制，在本研究中，我們再次確認了白楊素的抗炎作用，同前期實驗結果一致的是，白楊素在不影響細胞活力的劑量范圍內，顯著抑制促炎細胞因子IL-6，MCP-1，TNF-α和炎癥介質NO的合成和分泌，對誘導型NO合酶iNOS也有明顯的抑制作用，而對COX-2的影響相對較?。▓D2，3）。另外，我們進一步檢測發(fā)現(xiàn)，白楊素對iNOS的mRNA合成也有顯著的抑制作用（圖2）。因此，白楊素能夠通過下調炎癥相關細胞因子和炎癥介質的合成和分泌，發(fā)揮抗炎作用。

我們的蛋白質芯片篩選結果顯示，參與白楊素抗炎作用的信號通路中，AKT/mTOR 可能是主要的調控點。另外，我們在實驗中，設置不同時間檢測點，發(fā)現(xiàn)AKT，mTOR和P70S6K從0.5h開始磷酸化激活，PRAS40 從1 h 開始活化，而S6RP 從2 h 開始磷酸化（圖5）。在本實驗中，當脂多糖到達細胞表面，與受體結合后，受體激活PI3K的調節(jié)亞基（p85），并招募催化亞基（p110），進而催化細胞膜胞質側的PIP2生成PI3P，進一步激活AKT。AKT可以直接磷酸化PRAS40，使其解除對mTORC1的抑制作用。mTORC1復合體的下游效應分子主要是核糖體p70S6激酶蛋白（p70S6K）和真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白1。解除抑制并活化的mTORC1復合體磷酸化激活p70S6K，后者接著磷酸化S6RP，調控炎癥相關基因的表達［24］。白楊素通過阻斷PI3K/AKT/mTOR信號途徑，發(fā)揮抗炎作用。而白楊素是通過直接抑制AKT的磷酸化，還是更上游的靶點，需要進一步實驗驗證。

值得關注的是，PI3K/AKT/mTOR在調節(jié)包括細胞自噬，細胞凋亡在內的多種生物學過程時，受到ROS水平的影響［25-27］。在C6膠質瘤細胞中，ROS可以直接誘導mTOR和P70S6K的去磷酸化［28］。本實驗證實白楊素能夠將脂多糖激發(fā)的細胞內ROS，清除至本底水平（圖6）。另外，我們用ROS清除劑NAC，模擬白楊素的ROS抑制功能，發(fā)現(xiàn)脂多糖誘導合成的iNOS和COX-2顯著下調，對COX-2的抑制效果更明顯，而白楊素對iNOS的抑制作用相對較強，對COX-2的抑制作用較弱（圖2，7）。我們試著分析兩者抑制作用的差異，ROS在細胞內主要有兩大來源，線粒體和NADPH 氧化酶。NAC對ROS的作用是沒有選擇性的，可以清除任何來源的ROS，而白楊素可能只靶向抑制某個來源的ROS。蛋白質芯片篩選結果中提示，脂多糖能夠促進HSP27（Ser78）的磷酸化，白楊素能夠抑制其活化。熱休克蛋白另一家族成員HSP90可以與NADPH氧化酶亞基NOX1的C端結合，調控ROS生成［29-30］。白楊素可能通過HSP27調控NOX的功能，影響細胞內ROS含量。另外，用NAC處理細胞后，AKT/mTOR信號途徑中各信號分子的磷酸化活化程度均降低（圖7）。ROS可能是白楊素發(fā)揮抗炎作用的上游調控靶點。

綜上所述，白楊素通過抑制上游信號分子ROS的合成，進而抑制AKT/mTOR信號通路的活化，調控核糖體的翻譯過程，下調相關促炎細胞因子和炎癥介質的合成和釋放，發(fā)揮抗炎作用。本研究在前期實驗結果的基礎上，完善了白楊素的抗炎作用分子機制，為闡明白楊素的抗炎機理和拓寬白楊素的臨床用藥范圍，提供了基礎實驗依據(jù)。