活化的Mir-30a-wnt/β-catenin信號(hào)軸通過(guò)上調(diào)組織蛋白酶K的表達(dá)促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化

劉 芬，周志斐，薛 洋，朱 斌，吳補(bǔ)領(lǐng)，陳發(fā)明

1西北婦女兒童醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710000；第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院2牙周病科，5頜面外科，陜西 西安 710000；3南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院頜面外科，廣東 深圳 518000；4西藏軍區(qū)總醫(yī)院口腔科，西藏 拉薩 850000；6南方醫(yī)科大學(xué)深圳口腔醫(yī)院（坪山），廣東 深圳518000

牙周炎是牙齒支持組織在炎性侵犯下受到破壞的一類疾?。?］。流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果提示約10%的成年人和30%的50歲以上人群患有重度牙周炎。牙周炎不僅造成口腔局部組織礙害，還是多種全身系統(tǒng)性疾病的高危因素［2］。牙周治療的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)牙周組織再生［3］。近年來(lái)，以干細(xì)胞為主導(dǎo)的組織工程技術(shù)逐漸成為實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定牙周再生的研究熱點(diǎn)和臨床趨勢(shì)。組織工程技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用為牙周炎患牙的存留和預(yù)后改善提供了極大可能［4］。

牙骨質(zhì)是覆蓋牙根表面的薄層礦化組織。只有當(dāng)牙骨質(zhì)存在時(shí)，以膠原纖維為主要結(jié)構(gòu)的牙周膜才能穿通其中，建立類似天然牙的Sharpy's纖維結(jié)構(gòu)并發(fā)揮作用效應(yīng)。因此，牙骨質(zhì)的再生重建是整個(gè)牙周組織功能性再生的前提，也是牙周組織再生研究中的難點(diǎn)與挑戰(zhàn)。

釉基質(zhì)蛋白衍生物（EMD）是最早用于牙周炎臨床治療的輔助藥物［5］。動(dòng)物學(xué)和人體組織學(xué)研究結(jié)果均提示EMD局部應(yīng)用可有效促進(jìn)牙骨質(zhì)再生［6］。然而EMD促進(jìn)牙骨質(zhì)再生的機(jī)制并不清楚，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用的療效優(yōu)化。組織蛋白酶K（CTSK）是硬組織代謝的重要調(diào)節(jié)因子［7］。已經(jīng)證實(shí)，CTSK基因突變可導(dǎo)致致密性成骨不全綜合征，這類患者口腔改變中較為典型的表現(xiàn)即為顯著的牙骨質(zhì)增厚，但增厚的牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。意味著CTSK基因突變可導(dǎo)致正常牙骨質(zhì)生成障礙［8］。提示CTSK在牙骨質(zhì)發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是牙骨質(zhì)再生的重要調(diào)控因子［9］。

作者在前期研究中也已證實(shí)EMD作用能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞（PDLSC）成牙骨質(zhì)向分化，在細(xì)胞成牙骨質(zhì)向分化過(guò)程中CTSK表達(dá)特異性上調(diào)［10］。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步印證表達(dá)上調(diào)的CTSK對(duì)PDLSC成牙骨質(zhì)向分化具有促進(jìn)作用［10］。然而，EMD上調(diào)CTSK表達(dá)的具體作用機(jī)制仍有待闡明。

本實(shí)驗(yàn)擬首先通過(guò)microRNA芯片篩選EMD誘導(dǎo)PDLSC過(guò)程中差異表達(dá)的microRNA，之后驗(yàn)證相關(guān)microRNA同CTSK表達(dá)及PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的相互作用關(guān)系。并觀察wnt信號(hào)通路在microRNA調(diào)節(jié)過(guò)程中是否發(fā)揮了相應(yīng)功效。以期為揭示PDLSC成牙骨質(zhì)分化過(guò)程中CTSK表達(dá)升高的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為明確調(diào)控PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的關(guān)鍵通路，實(shí)現(xiàn)更好的定向誘導(dǎo)提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 樣本來(lái)源

本研究所用細(xì)胞來(lái)自第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙槽外科因正畸治療需要而減數(shù)拔除的前磨牙或第三磨牙。所有供體牙齒均呈無(wú)齲健康狀態(tài)。在拔除前影像學(xué)檢查均提示無(wú)急慢性炎癥表現(xiàn)。所有牙齒來(lái)源的供體無(wú)全身系統(tǒng)性疾病，在近1年內(nèi)無(wú)吸煙史及影響全身狀況的特殊藥物服用史。樣本年齡分布為14～35歲，均值為21.5歲。

本研究實(shí)驗(yàn)方案已獲口腔醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，且在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前面向每個(gè)患者及其監(jiān)護(hù)人告知實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c牙齒收集的用途，在獲得知情同意之后正式簽署書面同意書。

1.2 PDLSC的分離與培養(yǎng)

PDLSC的分離培養(yǎng)步驟按照前期研究進(jìn)行［11］。首先利用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（Beyotime Biotechnology）沖洗新鮮拔除的牙齒。之后仔細(xì)刮除根中1/3牙周膜組織并剪成大小約1×mm×1×mm×1×mm的小塊。利用5倍于組織塊體積的0.1% I 型膠原酶（Sigma-Aldrich，Spruce）37 ℃消化牙周膜組織15 min，之后加入等體積含有10%胎牛血清（HyClone）的α-MEM 培養(yǎng)液（HyClone）終止消化。離心棄去含膠原酶的混合液后用含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素（Invitrogen）和100 mg/mL鏈霉素（Invitrogen）雙抗的原代α-MEM培養(yǎng)液重懸牙周膜組織。最后，將牙周膜組織接種于六孔板，放置于37 ℃，含95%空氣和5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

當(dāng)組織塊周圍細(xì)胞融合，利用0.25%胰蛋白酶（pH=8.0～9.0,Beyotime）消化細(xì)胞。極限稀釋法收集單克隆增殖的細(xì)胞集落體外擴(kuò)大培養(yǎng)獲得PDLSC［11］。本研究使用第2～4代PDLSC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 EMD誘導(dǎo)

EMD（Biora）溶解于1 ml/L醋酸（Ruimen，Jinan）溶液中保存，其終濃度為10 mg/mL，保存溫度為-20 ℃。將EMD誘導(dǎo)組的PDLSC以1×104/孔密度接種于六孔板中。24 h后待細(xì)胞貼壁，更換含有終濃度為100 mg/L EMD的α-MEM培養(yǎng)液［10］。EMD誘導(dǎo)48 h后取樣觀察相關(guān)信號(hào)通路及調(diào)控因子的表達(dá)改變。

1.4 microRNA芯片檢測(cè)

MicroRNA芯片檢測(cè)樣本分為2組：實(shí)驗(yàn)組為EMD誘導(dǎo)作用組PDLSC，對(duì)照組為無(wú)特殊處理PDLSC。EMD誘導(dǎo)終止細(xì)胞培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)液，利用PBS蕩洗2遍。分別向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組PDLSC中加入裂解/結(jié)合緩沖液（lysis/bingding buffer,Invitrogen），裂解細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。吹打細(xì)胞懸液呈均勻狀態(tài)后轉(zhuǎn)移至EP管行microRNA 芯片檢測(cè)（Aksomics,Agilent Human miRNA Microarray,Release 21.0）。

1.5 RNA提取和RT-qPCR檢測(cè)

根據(jù)商品說(shuō)明書，利用Trizol（Invitrogen）試劑提取RNA。之后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）將所得的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR 的反應(yīng)體系為20 μL，基于RT-qPCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM II，Takara）的使用說(shuō)明進(jìn)行。RT-qPCR在CFX Connect?實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad,HercμLes）內(nèi)開(kāi)展。對(duì)于每種檢測(cè)基因，獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。在本實(shí)驗(yàn)中所使用的引物序列如下（表1）。其中，由于miR-30a成熟形式差異通常較為輕微，因此在本研究中擴(kuò)增其前體形式來(lái)比較miR-30a的表達(dá)差異。

表1 本研究所使用的引物序列Tab.1 Primer sequence used in this study

1.6 miR-30a抑制劑轉(zhuǎn)染

首先設(shè)計(jì)miR-30a 抑制劑序列：CUUCCAG UCGAGGAUGUUUACA；并同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照序列：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA。在進(jìn)行抑制劑轉(zhuǎn)染前，PDLSC的培養(yǎng)液更換為不含抗生素的α-MEM以保證理想的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)miR-30a抑制劑和陰性對(duì)照序列分別進(jìn)行稀釋，使其終濃度為100 nmol/μL。首先將10 μL抑制劑稀釋至250 μL，稀釋液為opti-MEM，作用10 min。此后，用250 μL opti-MEM 稀釋5 μL lip 2000，作用10 min。最后將兩者混合，輕輕吹打均勻后室溫作用20 min。用無(wú)血清的α-MEM將六孔板中的細(xì)胞清洗2次后每孔加入3 mL無(wú)血清α-MEM及抑制劑轉(zhuǎn)染體系。放入孵箱作用6 h后棄去無(wú)血清培養(yǎng)液，加入正常含10%胎牛血清的α-MEM，繼續(xù)孵育18 h。

1.7 蛋白提取和Western blot檢測(cè)

Western blot檢測(cè)按照前期研究步驟進(jìn)行［12］。本實(shí)驗(yàn)所用一抗如下：小鼠抗人磷酸化GSK-3β一抗（1∶200稀釋，Santa Cruz Biotechnology）；羊抗人DKK1 一抗（1∶200稀釋，Abcam）；小鼠抗人active-β-catenin一抗（1∶100稀釋，Millipore）；羊抗人CTSK一抗（1∶100稀釋，Santa Cruz）及小鼠抗人β-actin 一抗（1∶2000 稀釋，CWBiotech）。本實(shí)驗(yàn)所用二抗為結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的羊抗小鼠二抗（1∶5000 稀釋，Jacson Immuno Research，West Grove）和驢抗羊二抗（1∶5000 稀釋，CWBiotech）。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步研究PDLSC體內(nèi)異位成牙骨質(zhì)向分化，將不同處理（EMD誘導(dǎo)，miR-30a抑制劑轉(zhuǎn)染，CTSK慢病毒激活顆粒轉(zhuǎn)染）的細(xì)胞膜片包被孔狀陶瓷羥基磷灰石材料（四川大學(xué)）植入裸鼠背部皮下。實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的購(gòu)買、飼養(yǎng)及處理方案經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。不同處理（EMD誘導(dǎo)，miR-30a抑制劑轉(zhuǎn)染，CTSK慢病毒激活顆粒轉(zhuǎn)染）的PDLSC首先按照2×105/孔的密度植入六孔板中，含10%胎牛血清（HyClone）的α-MEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。之后換做EMD誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)14 d直至細(xì)胞膜片形成?？谞钐沾闪u基磷灰石材料被加工成3 mm×5 mm的圓柱形用作細(xì)胞支架。細(xì)胞-支架材料復(fù)合材料植入裸鼠（6周齡雄性，空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）背部皮下。8周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。取出復(fù)合材料通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析相關(guān)改變。

1.9 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

孔狀陶瓷羥基磷灰石材料固定后在10%EDTA溶液中脫鈣15 d。制備6 μm厚度的連續(xù)石蠟切片時(shí)，垂直圓柱形材料的長(zhǎng)軸進(jìn)行切取。本研究開(kāi)展免疫組織化學(xué)檢測(cè)時(shí)所用的一抗有小鼠抗人CAP一抗（1∶500稀釋，Santa Cruz）及羊抗人CEMP-1 一抗（1∶500 稀釋，Santa Cruz）。滴加二抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（ZSGB-Bio）室溫孵育后利用DAB顯色液（Hat Biotechnology）進(jìn)行顯色。Image Pro Plus 6.0（Azure Biosystems）軟件分析所拍攝的圖像。

1.10 CTSK慢病毒激活顆粒轉(zhuǎn)染

消化后將2×105細(xì)胞接種于6孔板，待其貼壁并生長(zhǎng)至6孔板底部約60%面積時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行CTSK慢病毒激活顆粒（Santa Cruz）轉(zhuǎn)染。首先在α-MEM培養(yǎng)液中加入5μg/mL聚凝胺（Polybrene?，Santa Cruz）作用12 h，之后將慢病毒顆粒添加入細(xì)胞培養(yǎng)體系。應(yīng)用包含有5μg/mL二鹽酸嘌呤霉素（Santa Cruz），300μg/mL潮霉素B（Santa Cruz）以及10 μg/mL 鹽酸殺稻瘟菌素S（Santa Cruz）的α-MEM，針對(duì)表達(dá)穩(wěn)定的含有CTSK慢病毒激活顆粒細(xì)胞進(jìn)行挑選。每間隔3 d更換1次培養(yǎng)液。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

各實(shí)驗(yàn)使用不同批次細(xì)胞獨(dú)立重復(fù)3次，各指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組間的樣本對(duì)比使用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMD作用PDLSC后差異表達(dá)microRNA的芯片檢測(cè)

芯片檢測(cè)結(jié)果提示（表2），EMD誘導(dǎo)48 h后，15種microRNA表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，21種microRNA表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。在表達(dá)發(fā)生變化的36種microRNA中，同細(xì)胞增殖相關(guān)的microRNA有14種，分別為：miR-100、miR-1183、miR-144-3p、miR-182、miR-134、miR-141、miR-143、miR-21、miR-101-3p、miR-30a、miR-1、miR-1060、miR-424、miR-138。同細(xì)胞分化相關(guān)的microRNA有16種，分別為：miR-31、miR-144-3p、miR-214、miR-9、miR-145、miR-143、miR-451、miR-486、miR-24、miR-21、miR-210、miR-223、miR-133、miR-1256、miR-30a、miR-155。同細(xì)胞增殖與分化均密切相關(guān)的microRNA有4種，分別為：miR-144-3p、miR-143、miR-21、miR-30a。其中，miR-144-3p和miR-143表達(dá)下調(diào)，miR-21和miR-30a表達(dá)上調(diào)。

2.2 EMD作用后PDLSC差異表達(dá)microRNA的篩選

對(duì)初篩的4種microRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)（圖1）：EMD作用24 h后，miR-144-3p表達(dá)下調(diào)，這一下調(diào)趨勢(shì)持續(xù)至48 h（P<0.05）。至EMD 作用72 h，miR-144-3p 表達(dá)同對(duì)照組相比已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，圖1A）。而對(duì)于miR-143，在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1B），這一結(jié)果與microRNA基因芯片結(jié)果相悖。在EMD 誘導(dǎo)24 h后，miR-30a的表達(dá)無(wú)顯著改變（P>0.05），但在48 h后，miR-30a的表達(dá)逐漸升高，且呈時(shí)間依賴性（P<0.05，圖1C）。而miR-21的表達(dá)在EMD作用延長(zhǎng)至96 h時(shí)，上調(diào)趨勢(shì)得到抑制，差異同EMD作用24 h相比并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1D）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇miR-30a為研究對(duì)象。

2.3 miR-30a在EMD上調(diào)PDLSC CTSK表達(dá)中的作用

首先通過(guò)miR-30a抑制劑沉默PDLSC中miR-30a的表達(dá)。細(xì)胞模型構(gòu)建成功后利用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證（圖2）。EMD誘導(dǎo)48 h后，PDLSC中miR-30a表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。miR-30a抑制劑作用組的細(xì)胞miR-30a表達(dá)下調(diào)，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-30a抑制劑作用組的細(xì)胞在EMD作用下miR-30a表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)得到逆轉(zhuǎn)。

圖2 EMD及miR-30a抑制劑對(duì)PDLSC miR-30a表達(dá)變化的影響Fig.2 Effects of EMD and miR-30a inhibitor toward the expression of miR-30a in PDLSC.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

當(dāng)抑制PDLSC中miR-30a的表達(dá)后，CTSK無(wú)論mRNA（圖3A）還是蛋白（圖3B）的表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)均得到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 EMD及miR-30a抑制劑對(duì)PDLSC CTSK表達(dá)變化的影響Fig.3 Effects of EMD and miR-30a inhibitor on expression of CTSK in PDLSC.A:qPCR results showing the effect of miR-30a inhibition on CTSK mRNA expression in PDLSC with EMD induction.B:Western blotting results of CTSK protein expression.**P<0.01.

進(jìn)一步將不同處理的PDLSC復(fù)合支架材料植入裸鼠皮下，觀察細(xì)胞在體內(nèi)異位成牙骨質(zhì)向分化的情況（圖4）。EMD作用后PDLSC成牙骨質(zhì)向分化作用顯著增強(qiáng)。而在miR-30a表達(dá)被沉默后，細(xì)胞在EMD誘導(dǎo)環(huán)境中定向分化能力減弱。但在增強(qiáng)miR-30a表達(dá)沉默PDLSC中CTSK的活性后，miR-30a抑制劑對(duì)PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的抑制作用得到逆轉(zhuǎn)。

圖4 miR-30a調(diào)控PDLSC CTSK表達(dá)對(duì)細(xì)胞成牙骨質(zhì)向分化的影響Fig.4 Effects of miR-30a inhibitor and CTSK activator on cementogenic differentiation of PDLSCs.Up:Original magnification:×40;Down:×200.

2.4 miR-30a通過(guò)wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)PDLSC CTSK的表達(dá)

Western blot檢測(cè)顯示在EMD誘導(dǎo)48 h后，PDLSC中wnt/β-catenin信號(hào)通路被特異性激活，表現(xiàn)為磷酸化GSK-3β表達(dá)上調(diào)，活化型β-catenin表達(dá)顯著升高（圖5）。而wnt通路的抑制因子DKK1表達(dá)降低。當(dāng)利用miR-30a 抑制劑沉默PDLSC miR-30a表達(dá)后，EMD對(duì)wnt信號(hào)通路的活化作用減弱。

圖5 EMD及miR-30a抑制劑對(duì)PDLSC wnt通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of EMD and miR-30a inhibitor on expressions of related proteins of wnt signaling pathway in PDLSCs.

而當(dāng)利用wnt 信號(hào)通路特異性阻斷劑DKK1（10 ng/mL）阻斷PDLSC wnt信號(hào)通路后，qPCR檢測(cè)顯示EMD誘導(dǎo)環(huán)境中PDLSC CTSK表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)得到部分逆轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖6A）。蛋白檢測(cè)結(jié)果（圖6B）進(jìn)一步印證了mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。

圖6 EMD及DKK1對(duì)PDLSC CTSK表達(dá)變化的影響Fig.6 Effects of EMD and DKK1 on expression of CTSK in PDLSC.A:qPCR results of CTSK mRNA expression in PDLSCs with EMD induction after inhibiting the wnt signaling pathway.B:Western blotting of CTSK protein expression.*P<0.05,**P<0.01.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)microRNA基因芯片結(jié)合qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)EMD 誘導(dǎo)PDLSC 成牙骨質(zhì)向分化過(guò)程中miR-30a表達(dá)特異性上調(diào)。EMD通過(guò)miR-30a調(diào)控CTSK表達(dá)促進(jìn)PDLSC成牙骨質(zhì)向分化。而miR-30a調(diào)節(jié)CTSK表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮功能效應(yīng)可能經(jīng)由wnt/β-catenin信號(hào)通路。

MicroRNA同干細(xì)胞分化密切相關(guān)。包括腫瘤間質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的多種干細(xì)胞或前體細(xì)胞中廣泛存在microRNA的表達(dá)，不同表達(dá)量的microRNA對(duì)細(xì)胞功能的影響發(fā)揮著不同作用，影響著細(xì)胞增殖和分化等基本功能［14］。因此，microRNA在多種疾病的病理發(fā)生和病程調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵效應(yīng)。在皮膚組織中，microRNA能夠調(diào)控基底細(xì)胞的“干性”促進(jìn)新陳代謝，維持皮膚組織穩(wěn)態(tài)［15］。肌細(xì)胞中，以miR-206為代表的microRNA其主要作用就在于促進(jìn)肌細(xì)胞的前體細(xì)胞分化形成肌肉組織［16］。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中，也存在microRNA 表達(dá)譜的改變，提示這一過(guò)程同樣受microRNA調(diào)控［17］。MicroRNA主要通過(guò)作用于目標(biāo)mRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，因此其在細(xì)胞中的效應(yīng)機(jī)制較為復(fù)雜。多個(gè)microRNA可能作用于同一個(gè)mRNA，也有可能單個(gè)microRNA下游存在多個(gè)可能的靶向mRNA。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)microRNA芯片對(duì)PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過(guò)程中差異性表達(dá)的microRNA進(jìn)行了篩選，結(jié)果也提示15種microRNA表達(dá)下調(diào)，21 種microRNA表達(dá)上調(diào)。提示microRNA對(duì)PDLSC的分化也發(fā)揮著可能的調(diào)控作用。

在表達(dá)發(fā)生改變的microRNA中，miR-144-3p［18-19］、miR-143［20-21］、miR-30a［22-23］和miR-21［24-25］同細(xì)胞增殖及分化均密切相關(guān)。結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，最終選擇miR-30a作為后續(xù)研究的目標(biāo)。miR-30a作為同細(xì)胞分化和增殖均密切相關(guān)的microRNA，在EMD作用后的PDLSC中表達(dá)上調(diào)且表達(dá)趨勢(shì)較為穩(wěn)定。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)我們也證實(shí)其參與了PDLSC成牙骨質(zhì)向分化和對(duì)這一過(guò)程關(guān)鍵因子CTSK的表達(dá)調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)與前期研究類似。學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-30a是間充質(zhì)細(xì)胞成軟骨分化過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子［26］。不僅能夠通過(guò)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子直接影響細(xì)胞分化，還可能同淋巴細(xì)胞等相互作用發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)間接對(duì)細(xì)胞分化產(chǎn)生影響［23］。在口腔牙周組織中，miR-30a不僅參與了牙周組織炎性損傷，也調(diào)節(jié)著牙周炎患者組織修復(fù)過(guò)程［27］，這一發(fā)現(xiàn)與本研究類似。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果擴(kuò)大了對(duì)miR-30a在干細(xì)胞分化尤其是口腔牙周組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化過(guò)程中的認(rèn)識(shí)。

在明確miR-30a對(duì)CTSK發(fā)揮調(diào)控作用進(jìn)而調(diào)節(jié)PDLSC成牙骨質(zhì)向分化后，我們觀察了wnt信號(hào)通路在這一調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮的可能分子機(jī)理。既往已有多個(gè)研究證實(shí)wnt/β-catenin信號(hào)通路是礦化組織發(fā)生和再生的調(diào)節(jié)通路［28］。它可以通過(guò)調(diào)控包括PDLSC在內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化促進(jìn)骨及類骨組織形成［29］。在本研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMD誘導(dǎo)作用下wnt通路相關(guān)因子p-GSK-3β和核心調(diào)控因子活化型β-catenin表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)，而通路抑制因子DKK1表達(dá)則顯著下調(diào)。提示在PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過(guò)程中伴隨wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。但較之于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其他組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，wnt信號(hào)通路在牙周組織穩(wěn)態(tài)的維持中功能作用發(fā)揮仍有一定爭(zhēng)議。雖然體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)wnt通路能夠上調(diào)牙周膜組織來(lái)源細(xì)胞表達(dá)成骨分化標(biāo)志物如Osterix，Runx2和ALP［30］，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)wnt通路能夠抑制牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)向分化，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖，作者考慮與誘導(dǎo)微環(huán)境存在關(guān)聯(lián)。Wnt通路在PDLSC牙周再生應(yīng)用或成牙骨質(zhì)向分化中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究［31］。

Wnt信號(hào)通路不僅參與以PDLSC作為種子細(xì)胞的牙周組織再生，其功能作用發(fā)揮也受microRNA的調(diào)節(jié)。MiR-128通過(guò)調(diào)控wnt通路能夠影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化［32］；wnt3a受miR-410的負(fù)性調(diào)控從而促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨方向分化［33］，而miR-27則可以靶向作用于APC激活wnt信號(hào)通路促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化［34］。具體到miR-30a，已有學(xué)者證實(shí)miR-30a可以靶向作用于PR結(jié)構(gòu)域蛋白1基因通過(guò)DKK1調(diào)控wnt信號(hào)通路從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。此外，miR-30a和wnt/β-catenin信號(hào)通路之間的交互作用也為骨髓瘤的治療提供了新的思路［35］。我們的研究結(jié)果也提示，EMD 誘導(dǎo)作用下，PDLSC miR-30a的表達(dá)和wnt信號(hào)通路的激活間存在相關(guān)性，且wnt信號(hào)通路的激活影響PDLSC成牙骨質(zhì)向分化重要調(diào)控因子CTSK的表達(dá)。

MicroRNA功能作用的發(fā)揮多在于其通過(guò)負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響下游通路。在本研究中，我們初步探討了PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過(guò)程中CTSK表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，即EMD上調(diào)miR-30a的表達(dá)進(jìn)而通過(guò)激活wnt信號(hào)通路上調(diào)CTSK表達(dá)。由此作者推測(cè)MiR-30a上調(diào)wnt信號(hào)通路的可能途徑有兩條：其一在于直接靶向作用于wnt通路的負(fù)性調(diào)控因子，但相關(guān)機(jī)制有賴于進(jìn)一步生物信息學(xué)的驗(yàn)證；其二在于間接作用于下游的靶向轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而間接抑制wnt通路。因此，在后續(xù)研究中，作者將進(jìn)一步通過(guò)生信分析來(lái)明確miR-30a激活wnt 通路的目標(biāo)靶基因并通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，miR-30a-wnt/β-catenin信號(hào)軸在PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過(guò)程中除調(diào)節(jié)CTSK的表達(dá)外，是否可能存在其他功能作用，也是后續(xù)研究的方向之一。

結(jié)合前期研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明CTSK是EMD通過(guò)miR-30a調(diào)控PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。然而，現(xiàn)有文獻(xiàn)缺乏CTSK在wnt通路作用下自身表達(dá)調(diào)控及調(diào)控干細(xì)胞定向分化的效應(yīng)機(jī)制相關(guān)報(bào)道。在后續(xù)研究中，作者將結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子芯片及生物信息學(xué)分析等技術(shù)，以CTSK為中心，深入開(kāi)展效應(yīng)機(jī)制的探索。

綜上所述，PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過(guò)程中，EMD可能通過(guò)上調(diào)miR-30a的表達(dá)激活wnt/β-catenin信號(hào)通路從而經(jīng)CTSK誘導(dǎo)PDLSC向成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化。本研究有望為揭示PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過(guò)程中CTSK表達(dá)升高的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為明確調(diào)控PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的關(guān)鍵通路實(shí)現(xiàn)更好的定向誘導(dǎo)提供理論依據(jù)。