假芝子實(shí)體粗多糖組成及抗氧化和免疫活性研究

肖自添，何煥清，彭洋洋，劉 明，徐 江

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省草菇科技創(chuàng)新中心/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】假芝〔Amauroderma rugosum（Blume &T.Nees）Torrend〕是靈芝科假芝屬真菌，因子實(shí)體損傷后會分泌血紅色物質(zhì)，民間也稱之為“血芝”［1］。我國假芝屬真菌資源豐富，目前已鑒定的有22 個種，分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，廣東、廣西、云南、福建、臺灣、貴州、香港、海南等地均有發(fā)現(xiàn)［2］。假芝被認(rèn)為是《神農(nóng)本草經(jīng)》記載的“六芝”中的“黑芝”，具有悠久的民間藥用歷史［3］?，F(xiàn)代研究表明，假芝屬真菌具有消炎［4］、抗腫瘤［5］、免疫調(diào)節(jié)［6］、抗氧化［7］等作用，且部分活性優(yōu)于多種已被熟知的食藥用菌，極具研究開發(fā)利用價值。【前人研究進(jìn)展】對假芝屬真菌子實(shí)體和菌絲體發(fā)酵菌液的成分分析表明，有機(jī)相提取物中的麥角甾醇、巴西紅厚殼素、6-脫氧巴西紅厚殼素、乙醇提取物等成分具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、抑制LPS 誘導(dǎo)NO 產(chǎn)生、促進(jìn)消炎因子IL-10 表達(dá)等作用［8-11］；水提物，如多糖等也具有免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤細(xì)胞生長等作用，其作用機(jī)理可能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤生長［12-13］。通過急性和亞慢性毒理實(shí)驗(yàn)，表明皺蓋假芝多糖對動物體無明顯毒性，麥角甾醇組分對成纖細(xì)胞系（正常細(xì)胞）NIH3T3 在0～150 μmol/L 無明顯細(xì)胞毒性，表明皺蓋假芝自然提取物安全性高［14］。靈芝多糖具有“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”的作用，是一種優(yōu)良的抗氧化活性物質(zhì)［15］，不同靈芝品種多糖含量及其抗氧化活性各不相同［16-17］，真菌多糖的活性與多糖的相對分子質(zhì)量、單糖組成、糖苷鍵類型、一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)等相關(guān)［18］。目前對假芝屬真菌多糖研究報道較少，潘鴻輝等［19］分離提取了皺蓋假芝（Amauroderma rude）子實(shí)體多糖F212，對其單糖組成分析表明，該糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等7 種單糖組成，多糖F212 具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性，可以增強(qiáng)免疫功效。伍燕等［20］對假芝菌絲體多糖純化、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性做了相關(guān)研究，結(jié)果顯示該多糖由半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成，其中半乳糖含量最高，抗氧化試驗(yàn)表明假芝菌絲體粗多糖效果優(yōu)于精制多糖。

【本研究切入點(diǎn)】本課題組從廣州市白云山采集分離得到一株野生假芝（Amauroderma rugosumBYWZ），成功馴化栽培，其子實(shí)體水提液抗氧化活性比目前常規(guī)栽培的靈芝、紫芝強(qiáng)［21］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在前期研究基礎(chǔ)上開展馴化假芝子實(shí)體粗多糖組成、抗氧化活性等研究，以期促進(jìn)假芝多糖的深入開發(fā)利用，為開發(fā)抗氧化功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馴化栽培的野生假芝（Amauroderma rugosumBYWZ）子實(shí)體，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云試驗(yàn)基地2018 年1—6 月栽培獲得（圖1）。子實(shí)體經(jīng)烘箱60 ℃烘干，干燥陰涼處存放備用。

羥基自由基試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HNY-200D 恒溫?fù)u床（天津歐諾）；SANYO MLS-3750滅菌鍋（日本）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；恒溫水浴鍋HH-4（邦西儀器）；SWCJ-1CU 超凈工作臺（蘇州安泰）；全波長酶標(biāo)儀Multiskan Spectrum（芬蘭Thermo Scientific）；紫外可見分光光度計(jì)Beckman Coulter DU 800（美國）；18ND 真空冷凍干燥機(jī)（寧波新芝）等。

1.2 多糖樣品制備

取假芝干品100 g，粉碎，按1 ∶20 料液比加入蒸餾水，置100 ℃水浴3 h，室溫冷卻，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適當(dāng)體積，用胰蛋白酶法和Sevage 法去蛋白，透析，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適當(dāng)體積，真空冷凍干燥，得假芝子實(shí)體粗多糖（圖2）。胰蛋白酶法和Sevage 法去蛋白具體步驟：

將粗多糖溶液pH 值調(diào)至8，2%濃度胰蛋白酶酶液和粗多糖溶液分別同時放入37 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，再把兩者充分混合（酶液∶樣液=1 ∶10），震蕩30 min 后放入100 ℃水浴鍋中滅酶10 min，冷卻至室溫，加入1/4 體積Sevage試劑，劇烈震蕩20 min，分液漏斗分離，取上清，3 次重復(fù)，得清液。將去蛋白的多糖清液倒入透析袋中（MD5000），用夾子夾緊避免漏液，置于去離子水容器中靜置透析，每4～8 h 更換超純水一次，直至透析液清澈，約48 h。

1.3 多糖含量檢測

采用苯酚-濃硫酸法測定假芝子實(shí)體粗多糖含量。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 子實(shí)體多糖溶液配制 稱取假芝子實(shí)體粗多糖，用蒸餾水配成0.5、07、0.9、1.0、1.5 mg/mL 不同濃度樣液，進(jìn)行總抗氧化能力、羥基自由基清除率測定，3 次重復(fù)。

1.4.2 總抗氧化能力（T-AOC）測定 ABTS 在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS自由基，在抗氧化物存在時，ABTS自由基的產(chǎn)生會被抑制，在405 nm 或734 nm 測定ABTS 自由基的吸光度即可計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。Trolox 是一種Ve 類似物，具有抗氧化能力，用作其他抗氧化物總抗氧化能力的參考。具體操作依照試劑盒具體要求進(jìn)行。

ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率（%）=（A0-A）/A0×100

式中，A0為ABTS自由基溶液的吸光度，A 為加藥液后的吸光度。

1.4.3 羥基自由基（OH·-）清除率測定 具體操作依照試劑盒具體要求進(jìn)行。按照試劑盒步驟配制好試劑，應(yīng)用液先在37 ℃水浴中預(yù)熱3 min，然后分別在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對照管、測定管添加試劑，底物應(yīng)用液、樣本、試劑三應(yīng)用液、混勻，37 ℃反應(yīng)1 min，立即加入顯色劑終止反應(yīng)，混勻，室溫放置20 min 后550 nm 測定吸光值。

羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率（%）=（對照OD 值-測定OD 值）/對照OD 值×100

1.5 假芝子實(shí)體粗多糖對巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖的影響測定

試驗(yàn)委托廣州市欣源生物科技有限公司完成，RAW264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞購自廣州速業(yè)生物科技有限公司，采用MTS 法檢測細(xì)胞增殖。試驗(yàn)設(shè)5 個不同濃度處理，分別為0、25、50、100、200 μg/mL 假芝子實(shí)體粗多糖，3次重復(fù)。

1.6 多糖單糖組分及蛋白質(zhì)含量測定

試驗(yàn)委托北京中科光析化工技術(shù)研究所（食品實(shí)驗(yàn)室）完成，假芝子實(shí)體粗多糖分子量（GPC凝膠滲透色譜）、蛋白質(zhì)（凱氏定氮）、氨基酸含量（HPLC）、單糖組成（HPLC）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 假芝子實(shí)體粗多糖總抗氧化能力

ABTS 自由基清除率用于評價抗氧化能力大小，清除率越大表明該物質(zhì)抗氧化能力越強(qiáng)。假芝子實(shí)體粗多糖總抗氧化活性（ABTS 法）如圖3 所示。隨著假芝子實(shí)體提取的粗多糖質(zhì)量濃度增大，ABTS 自由基清除率升高，清除率與質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系；當(dāng)濃度為0.7 mg/mL 時，清除率超過50%，當(dāng)濃度為1.5 mg/mL 時清除率達(dá)83.95%，與1.0 mg/mLTrolox 標(biāo)準(zhǔn)物清除率（83.79%）相當(dāng)（圖4）。假芝子實(shí)體粗多糖ABTS 自由基清除率EC50值為0.74 mg/mL，Trolox標(biāo)準(zhǔn)物EC50為0.62 mg/mL，表明假芝子實(shí)體粗多糖總抗氧化活性較好。

2.2 假芝子實(shí)體粗多糖羥基自由基清除能力

羥基自由基活性強(qiáng)、毒性大，可以與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)造成損害，且反應(yīng)速度極快，假芝子實(shí)體提取的粗多糖羥基自由基清除能力如圖5 所示。隨著粗多糖質(zhì)量濃度增大，羥基自由基清除率逐漸增高，清除效果與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)；當(dāng)濃度為0.5 mg/mL 時，清除率為58.39%，優(yōu)于0.03%H2O2標(biāo)準(zhǔn)物清除率（46.8%），當(dāng)濃度為1.5 mg/mL 時清除率達(dá)90.26%，表明假芝子實(shí)體粗多糖羥基自由基清除能力較好。

2.3 假芝子實(shí)體粗多糖對巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖的影響

假芝子實(shí)體粗多糖對巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖的影響見圖6。在25～200 μg/mL 范圍內(nèi)，假芝子實(shí)體粗多糖能夠顯著促進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的增殖，增殖能力隨多糖濃度增大呈先升高后降低趨勢，多糖濃度為50 μg/mL 時促進(jìn)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)（圖6），與其他濃度沒有顯著差異，但均高于沒有添加多糖的，表明假芝多糖具有潛在的免疫調(diào)節(jié)能力。

2.4 假芝子實(shí)體粗多糖的單糖組分及含量

通過苯酚-硫酸法測得假芝子實(shí)體粗多糖含量為65.45%。由于粗多糖的單糖組成影響多糖的抗氧化活性，經(jīng)HPLC 測定，假芝子實(shí)體粗多糖是由多種單糖組成的雜多糖（圖7），由半乳糖、葡萄糖、甘露糖等10 種單糖組成，沒有檢測到果糖，其中半乳糖含量最高、達(dá)1.995%，其次是葡萄糖（1.612%）、甘露糖（1.259%），3 種單糖含量占總糖含量的67.87%，半乳糖醛酸（0.037%）、葡萄糖醛酸（0.074%）和木糖（0.13%）含量較低，巖藻糖（0.686%）、核糖（0.525%）、阿拉伯糖（0.474%）和鼠李糖（0.378%）含量居中。含量較高的半乳糖、甘露糖及葡萄糖可能是假芝子實(shí)體多糖具有較好抗氧化功效的原因之一。

2.5 假芝子實(shí)體粗多糖的蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成分析

由表1 可知，假芝子實(shí)體粗多糖蛋白質(zhì)含量為16.99%，含有17 種氨基酸，總氨基酸含量為7.48%，其中必需氨基酸含量占總氨基酸的28%，天冬氨酸和谷氨酸含量最高，分別為1.17%、1.11%，二者占氨基酸總量30.48%；其次為絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸，含量分別為0.79%、0.73%和0.73%，三者占30.11%；半胱氨酸和蛋氨酸含量最低，分別僅為0.02%和0.05%。天冬氨酸和谷氨酸被稱為鮮味氨基酸，絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸等被稱為甜味氨基酸，兩種氨基酸占比超過60%，使得假芝子實(shí)體粗多糖味道香濃，用作產(chǎn)品開發(fā)有一定優(yōu)勢。

表1 假芝子實(shí)體粗多糖的蛋白質(zhì)含量及氨基酸種類Table 1 Protein content and amino acid composition of crude polysaccharide from fruit body of Amauroderma rugosum

2.6 假芝子實(shí)體粗多糖的分子量

一般認(rèn)為分子量大小與多糖活性有關(guān)，大分子量多糖及其側(cè)鏈的連接方式對多糖的生物活性有重要影響，可確保高級結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象。分子量分布指數(shù)用來表示分子量分布程度的指數(shù)，數(shù)值比1 越大其分子量分布越寬，多分散性程度越大。多糖分子量分布系數(shù)α（Mw/Mn）越接近1，說明該多糖分子量分布較均一。假芝粗多糖數(shù)均分子量Wn 為28.239 ku，重均分子量Mw為57.502 ku，平均分子量Mp 為56.038 ku，更高的平均分子量Mz 為95.331ku，Mz+1 為130.852 ku，分子量分布Pd 為2.03629，分子量分布系數(shù)α（Mw/Mn）為2.036，表明假芝粗多糖分子鏈長短分布不均，也可能純度不夠，需要進(jìn)一步純化分析。

3 討論

多糖的抗氧化及免疫活性與其單糖組成、分子量、空間結(jié)構(gòu)等關(guān)系密切。伍燕等［20］對假芝菌絲體精制多糖進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該多糖由半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成，其中半乳糖含量最高，抗氧化試驗(yàn)表明假芝菌絲體粗多糖效果優(yōu)于精制多糖。潘鴻輝等［19］對皺蓋假芝子實(shí)體多糖F212 單糖組成分析表明，該糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、核糖等7 種單糖組成，多糖F212 具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性。而本試驗(yàn)子實(shí)體粗多糖組分不僅含有菌絲體測得的3 種單糖，還檢測出其他7 種，單糖組分中半乳糖、葡萄糖、甘露糖含量較高，未檢測出果糖，對ABTS 自由基、羥基自由基清除率高，一定范圍內(nèi)能夠顯著促進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)中，假芝子實(shí)體多糖比菌絲體多糖單糖組分更豐富，抗氧化效果明顯；與皺蓋假芝子實(shí)體多糖相比，多檢測出半乳糖醛酸、巖藻糖、葡萄糖醛酸等3 種單糖組分。戚夢等［22］對大革耳子實(shí)體多糖組分分析顯示，葡萄糖、甘露糖和木糖含量較高，對羥基自由基等清除能力較強(qiáng)。繡球菌子實(shí)體多糖則由葡萄糖、甘露糖、半乳糖木糖、果糖構(gòu)成，分子量在215～393 ku，具有一定的還原能力和清除DPPH 自由基的能力，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7 的增殖［23］。假芝子實(shí)體多糖相比菌絲體多糖組分更豐富，半乳糖、葡萄糖、甘露糖等含量較高，為重要單糖組分，可能與抗氧化及免疫活性有關(guān)。

糖蛋白（肽）復(fù)合物的功能與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。其中，相對分子質(zhì)量、多糖和蛋白含量、單糖和氨基酸組成、糖基化形式等對其體內(nèi)外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凝集等活性影響顯著［24］。靈芝多糖也常常含有蛋白或多肽片段，形成糖蛋白或者蛋白聚糖結(jié)構(gòu)，其分子質(zhì)量、多糖和蛋白質(zhì)含量、單糖和氨基酸組成、糖基化形式等對其生物活性有顯著影響［24］。本試驗(yàn)假芝子實(shí)體多糖含蛋白質(zhì)16.99%，由17 種氨基酸組成，多糖數(shù)均分子量Mn 為28.239 ku，重均分子量Mw 為57.502 ku，與報道的大多數(shù)靈芝多糖分子質(zhì)量Mw 數(shù)量級相當(dāng)，在104u 左右，水溶性較好，自由基清除效果較好。黃越等［25］也發(fā)現(xiàn)猴頭菇粗多糖組分中含有的蛋白質(zhì)是含有糖鏈和蛋白質(zhì)殘留的糖蛋白，具有較好的清除自由基能力。靈芝多糖也常含有蛋白或多肽片段，形成糖蛋白或者蛋白聚糖結(jié)構(gòu)，其分子量、多糖和蛋白質(zhì)含量、單糖和氨基酸組成、糖基化形式等對其生物活性有顯著影響［24-27］。一般認(rèn)為分子量大小與多糖活性有關(guān)，大分子量多糖及其側(cè)鏈的連接方式對多糖的生物活性有重要影響，可確保高級結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象。多糖分子量分布系數(shù)Mw/Mn 越接近1，說明該多糖分子量分布較均一，純度較高［28-29］。

4 結(jié)論

本研究首次對人工馴化栽培的假芝子實(shí)體多糖進(jìn)行分析，假芝子實(shí)體粗多糖ARP 為暗棕色粉末，對ABTS 自由基、羥基自由基清除率高，抗氧化效果好，在一定范圍內(nèi)能夠促進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的增殖。假芝子實(shí)體多糖是以半乳糖、葡萄糖、甘露糖等為主的蛋白質(zhì)雜多糖，多糖數(shù)均分子量Mn 為28.239 ku，重均分子量Mw 為57.502 ku，分子量分布系數(shù)（Mw/Mn）為2.036。粗多糖蛋白質(zhì)含量為16.99%，含有17 種氨基酸，其中必需氨基酸占總氨基酸的28%，天冬氨酸和谷氨酸含量最高，使得假芝子實(shí)體粗多糖香味濃郁。