吉非羅齊納米脂質(zhì)體的制備及降脂功效的研究①

張向宇， 付 琳， 高 嵩， 張 杰， 孟祥祎

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

吉非羅齊(Gemfibrozil,GEM)是最重要的貝特類(lèi)藥物之一，在高血脂癥的治療中起重要作用。它在人體內(nèi)溶解度較低，有效吸收量極少、消除半衰期短，所需給藥頻率較高等因素限制了它的應(yīng)用。納米脂質(zhì)體作為一類(lèi)新型藥物遞釋系統(tǒng)可以提高溶解度、穩(wěn)定性、增加制劑緩釋效果[1-3]。脂質(zhì)體(liposomes,LPs)一般是由膽固醇和磷脂構(gòu)成的球型微囊結(jié)構(gòu)的載體制劑，可以包載多種藥物[4-5]。吳敏等采用高壓均值法制備辛夷揮發(fā)油納米脂質(zhì)體，包封率79.4%，其在模擬釋放環(huán)境中30min內(nèi)有突釋?zhuān)会尯髮?shí)現(xiàn)緩慢釋放12h累積釋放量46.3%[6]。實(shí)驗(yàn)采用乙醇注入法制成吉非羅齊納米脂質(zhì)體(Gem-Nlps)，改善了吉非羅齊的溶解度，延長(zhǎng)體內(nèi)代謝時(shí)間，減少給藥次數(shù)；恢復(fù)血脂水平和體內(nèi)清除自由基的能力，降低動(dòng)脈硬化指數(shù)和血脂綜合指數(shù)，減輕氧化損傷。有望成為治療高血脂癥的有效制劑治療方案無(wú)效的重癥高血脂癥患者治療替代方案。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(上海力辰儀器科技有限公司)；KQ-2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；JY92-2D超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Agilent 1100series高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；Zetasizer Nano ZSE納米粒度電位儀(英國(guó)馬爾文公司)；Hitachi HT 7700型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；注射用大豆卵磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司)；膽固醇(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；吉非羅齊(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；甲醇為色譜純，其他有機(jī)試劑為分析純，水為雙蒸水。

雄性SPF級(jí)KM小鼠48只，購(gòu)買(mǎi)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證編號(hào)：201900030423，許可證號(hào)碼：SCXK(吉)-2018-0007

1.2 Gem-Nlps的制備

稱(chēng)取一定量的磷脂、膽固醇和GEM，將磷脂和膽固醇置于5 mL無(wú)水乙醇中超聲溶解為脂質(zhì)溶液。注射器抽一半體積的空白脂質(zhì)溶液后，向剩余脂質(zhì)溶液加入GEM超聲溶解，另取一注射器將其抽凈。然后將上述兩個(gè)注射器中的溶液緩慢滴入到裝有10 mL的PBS緩沖液中，在50 ℃下磁力攪拌器進(jìn)行攪拌。攪拌至完全除去乙醇，探頭超聲混懸液即得[7]。

1.3 GEM分析方法的建立

(1)色譜條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

色譜柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇：1%冰乙酸(75：25，V/V)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；進(jìn)樣量：20 μL。取GEM對(duì)照品和空白脂質(zhì)體，用甲醇稀釋至適宜濃度，在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取10 mgGEM標(biāo)準(zhǔn)品，放置于50 mL容量瓶，加甲醇溶解超聲并定容，搖勻。分別配制濃度為5,10,20,40,60,80和100 μg·mL-1的GEM甲醇溶液，采用HPLC以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)精密度及回收率測(cè)定

分別精密配制5,40,100 μg·mL-1的GEM溶液，在一日內(nèi)平行測(cè)定5次峰面積，通過(guò)濃度計(jì)算日內(nèi)精密度。同一時(shí)間測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。分別精密量取配置高、中、低三種濃度的GEM溶液，將樣品過(guò)0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)樣，利用峰面積計(jì)算回收率。

(4)包封率的測(cè)定

采用石油醚萃取法測(cè)Gem-Nlps的包封率，精密移取Gem-Nlps溶液0.5 mL，加入等量的石油醚萃取3次，此時(shí)溶液明顯分層，取下層溶液放入10 mL容量瓶中，加甲醇超聲破乳并定容，HPLC進(jìn)樣20 μL計(jì)算濃度，計(jì)算得W包。取0.5 mL的Gem-Nlps于10 mL容量瓶超聲破乳，同法計(jì)算W總，按公式(1)計(jì)算包封率：

(1)

2 Gem-Nlps的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1 Gem-Nlps理化性質(zhì)考察

根據(jù)最優(yōu)處方和工藝制備Gem-Nlps。用透射電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài)；室溫下用納米粒度儀測(cè)量Gem-Nlps粒徑大小、分布PDI指數(shù)和Zeta電位；石油醚萃取法測(cè)脂質(zhì)體包封率；pH測(cè)定；離心加速試驗(yàn)和穩(wěn)定性考察。

2.2 體外釋放實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用透析袋法模擬Gem-Nlps的體外釋放行為。取Gem-Nlps溶液和GEM藥物溶液(與脂質(zhì)體包封的藥物等量)各10 mL，平行3組，分別置于處理過(guò)的透析袋后扎緊兩端，沉浸在裝有500 mL介質(zhì)的燒杯中，溫度設(shè)定為(37±0.5)℃，將轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min。分別于0.25,0.5,0.75,1,2,4,8,10,12,18,24,36 h取樣，取樣后補(bǔ)加等溫的釋放介質(zhì)[8-9]。將樣品通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾進(jìn)HPLC測(cè)定計(jì)算累計(jì)釋放百分率。

2.3 高血脂模型小鼠降脂作用研究

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周將其隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性組、Gem-Nlps高、中、低濃度組?？瞻捉M灌胃生理鹽水(0.2 mL/10 g)，其他組均灌胃同等劑量的高脂乳劑。造模成功后開(kāi)始藥物治療，對(duì)空白組和模型組灌胃生理鹽水0.2 mL/10g，陽(yáng)性組灌胃等量辛伐他汀溶液，每日給藥一次。Gem-Nlps組小鼠分別灌胃高中低濃度Gem-Nlps，每?jī)商旖o藥一次。

末次給藥后禁食不禁水12 h，采用眼球取血法取小鼠血液，處死后剝離取出肝臟、皮下附睪和腎周的脂肪組織，稱(chēng)其濕重。測(cè)定小鼠的血液總膽固醇TC，甘油三酯TG，高密度脂蛋白膽固醇HDL-C，低密度脂蛋白膽固醇LDL-C，谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT，谷草轉(zhuǎn)氨酶AST，丙甲醛MDA，總超氧化物歧化酶T-SOD肝臟TG，TC等指標(biāo)。根據(jù)指標(biāo)按照公式(2)和(3)分別計(jì)算動(dòng)脈硬化指數(shù)AI和血脂綜合指數(shù)LCI。

(2)

(3)

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)的建立

(1)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

全波長(zhǎng)掃描可知GEM在276 nm和281 nm處有吸收峰，空白脂質(zhì)體在此處沒(méi)有干擾。我們選擇276 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做GEM標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為S=6.5455C+9.3589(r= 0.9997)，在5～100 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，如圖1所示。

圖1 GEM的標(biāo)準(zhǔn)曲線

(3)日內(nèi)日間精密度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三個(gè)濃度GEM溶液的日內(nèi)精密度RSD分別為1.430%，1.863%，1.207%，日間精密度RSD分別為1.777%，1.639%，1.151%，小于2%，符合方法學(xué)要求。

(4)回收率實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)得到濃度為5,40,100μg·mL-1的GEM溶液回收率分別為98.93%,99.63%和98.70%，回收率高，RSD值分別為1.343%,1.486%,1.154%，均小于2%，符合方法學(xué)要求。

3.2 Gem-Nlps的質(zhì)量考察

Gem-Nlps包封率為(80.73±1.65)%，載藥量為(6.48±0.12)%，如表1。透射電鏡視野下的Gem-Nlps形狀呈類(lèi)球形，粒徑平均，分散均勻，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象如圖2。粒徑為(122.82±3.61)nm，粒度分布圖呈單峰且無(wú)雜峰，PDI為0.181±0.01，分布均勻，如圖3所示。Zeta電位為(-23.77±0.60)mV，如圖4所示。

圖3 Gem-Nlps的粒徑及分布

圖4 Gem-Nlps的Zeta電位

表1 Gem-Nlps的包封率及載藥量(n=3)

圖2 Gem-Nlps透射電鏡照片(10K)

3.3 Gem-Nlps體外釋放

體外釋放結(jié)果見(jiàn)圖5在人工胃液和人工腸液中，Gem在4 h釋放超過(guò)80%。Gem-Nlps在胃液和腸液中2 h內(nèi)分別釋放19.29%和24.89%，不到40%，無(wú)突釋效應(yīng)。且在人工腸液中，Gem-Nlps在18 h時(shí)累計(jì)釋放率已超過(guò)80%，24 h時(shí)達(dá)到90.45%，說(shuō)明Gem-Nlps達(dá)到緩釋效果。

圖5 Gem和Gem-Nlps的體外累計(jì)釋放率(n=3)

3.4 高血脂模型小鼠降脂作用研究

(1)小鼠血脂指標(biāo)檢測(cè)情況

如圖6(a)，模型組相對(duì)空白組都具有極顯著差異(P<0.01)，其中TG,TC,LDL-C水平顯著增高，而HDL-C水平顯著降低，提示高脂模型造模成功；通過(guò)治療，各給藥組都有治療效果，其中Gem-Nlps高濃度組效果最佳。

圖6(b)可見(jiàn)，模型組的動(dòng)脈硬化指數(shù)AI和血脂綜合指數(shù)LCI指數(shù)增長(zhǎng)數(shù)倍。通過(guò)治療，陽(yáng)性組、Gem-Nlps高、中、低濃度組AI和LCI均降低且效果顯著。

(2)小鼠血清肝臟酶及抗氧化指標(biāo)情況

轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST指標(biāo)反映肝臟的損傷程度。由圖6(c)可知，模型組ALT和AST活力顯著高于空白組(P<0.01)，造模導(dǎo)致小鼠肝損傷。Gem-Nlps高、中濃度組和陽(yáng)性組對(duì)ALT,AST都有顯著的降低(P<0.01)。丙二醛(MDA)反映了細(xì)胞的受損程度。超氧化物歧化酶(T-SOD)反映機(jī)體清除自由基的能力[10]。MDA采用TBA法測(cè)定，T-SOD采用羥胺法測(cè)定。模型組的MDA相對(duì)于空白組明顯升高，T-SOD明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明小鼠由于高脂乳劑導(dǎo)致體內(nèi)發(fā)生氧化損傷。

(3)小鼠肝組織TC,TG水平情況

圖6(d)可知模型組的TC,TG指標(biāo)異常。治療后發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性組、Gem-Nlps高濃度組、中濃度組對(duì)于肝組織TC,TG均有控制效果，高濃度實(shí)驗(yàn)組效果最好。

圖6 (a)血清TG,TC,LDL-C,HDL-C水平;(b)AI,LCI值;(c)肝臟酶和抗氧化指標(biāo)的水平;(d)肝組織TG,TC水平

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)采用乙醇注入法制備Gem-Nlps，包封率在80%以上符合脂質(zhì)體包封率要求。脂質(zhì)體溶液外觀呈現(xiàn)淡藍(lán)色乳光，電鏡下為圓整球形，平均粒徑122nm，平均Zeta電位-23mV，呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。體外釋放結(jié)果表明Gem-Nlps有效的延長(zhǎng)了藥物的作用時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了緩釋作用。高血脂模型小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gem-Lips可以顯著降低TC,TG,LDL-C，升高HDL-C，從而降低了AI和LCI指數(shù)，而且Gem-Lips可以降低肝臟ALT和AST酶的活性，緩解高脂乳劑造成的肝臟損傷。在抗氧化指標(biāo)上。降低MDA水平，提高了T-SOD水平，具有增強(qiáng)機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化的效果。