ELISA法檢測(cè)油菜籽中的黃曲霉毒素B1

楊 權(quán)，孫婷琳，王 燕，余 佳，李利霞，熊 英*

（1.孝感市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北孝感 432000；2.湖北省糧油食品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，湖北武漢 43000； 3.三峽公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北宜昌 443000）

黃曲霉毒素是一組真菌（霉菌）毒素，是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物[1]，廣泛存在于花生、大豆等農(nóng)產(chǎn)品中，是影響花生、大豆、芝麻等農(nóng)產(chǎn)品油料質(zhì)量安全的重要因素。黃曲霉毒素具有毒性和強(qiáng)致癌性，毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥的毒性[2]。其中黃曲霉毒素B1是目前已知致癌性最強(qiáng)的天然毒素，對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，人、畜攝入了黃曲霉毒素超標(biāo)的食物或飼料，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。當(dāng)微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒，出現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性、肝硬化等，動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，體重減輕，母畜不孕或產(chǎn)仔少等系列癥狀，可誘發(fā)肝癌、胃癌等多種部位的癌癥。目前黃曲霉毒素的常規(guī)檢測(cè)方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及酶聯(lián)免疫吸附 法等[3-4]。

油菜是我國(guó)傳統(tǒng)的油料作物，也是我國(guó)主要的油料作物。菜籽油一直是我國(guó)居民的傳統(tǒng)生活用油，在我國(guó)植物油供給結(jié)構(gòu)中，菜籽油居第二位[5]。在菜籽油實(shí)際生產(chǎn)中，往往會(huì)由油菜籽中引入黃曲霉毒素B1，導(dǎo)致成品菜籽油中可能會(huì)含有微量黃曲霉毒素B1。在檢測(cè)黃曲霉毒素B1的不同方法中，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）由于其具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴的大型儀器等優(yōu)點(diǎn)，適用于油菜籽批量篩查檢驗(yàn)。本文擬采用ELISA法檢測(cè)油菜籽中的黃曲霉毒素B1含量，并選取合適的試驗(yàn)條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)）；磷酸氫二鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；磷酸二氫鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；超純水；HF4500酶標(biāo)儀（美正集團(tuán)生物科技有限公司）；高速離心機(jī)（湘儀H1850）；電子天平（梅特勒-托利多）；液相色譜（島津LC-20AT）。

油菜籽樣本，孝感市孝南區(qū)種植收獲采集。黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品；黃曲霉毒素B1ELISA檢測(cè)試劑盒（北京華安麥科生物有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油菜籽樣品前處理

采用60%、70%、80%、90%的甲醇-水作為樣本提取液，提取步驟為將油菜籽樣品混合均勻并粉碎（廣州市旭朗機(jī)械多功能切碎機(jī)，10～80目），稱取5.0 g經(jīng)粉碎的油菜籽樣品，加入25.0 mL上述不同濃度的提取液，在振蕩器上振搖 10.0 min（轉(zhuǎn)速為200 r/min），然后在4 000 r/min條件下離心5.0 min，過(guò)濾取濾液1 mL，再分別加入4 mL、5 mL、 9 mL不同體積的水和0.01 M磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋（即1∶4、1∶5、1∶9稀釋），即為樣本待測(cè)液。

1.2.2 ELISA試劑盒檢測(cè)樣本中AFB1

將酶聯(lián)免疫試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25 ℃）平衡30 min，取出微孔板，將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔盒樣本孔所在的位置；根據(jù)產(chǎn)品操作流程分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入AFB1酶標(biāo)物50 μL/孔，最后再加入AFB1試劑 50 μL/孔，用手輕敲震蕩混勻，用避光膜蓋住板，置室溫環(huán)境中反應(yīng)30 min；反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后，小心揭開(kāi)膜，將微孔內(nèi)液體甩干，用試劑盒中提供的洗滌液300 μL/孔，充分洗滌5次，每次間隔10 S，然后在吸水紙上拍干；加入底物顯色液100 μL/孔，輕敲震蕩混勻，用避光膜蓋好，置室溫環(huán)境反應(yīng)15 min；反應(yīng)時(shí)間結(jié)束，加入終止液50 μL/孔，輕輕震蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)A450/A630處測(cè)定每孔OD值。

1.3 定量分析方法

采用試劑盒專用的分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，該試劑盒標(biāo)示靈敏度為0.03 μg/kg，變異系數(shù)小于10%。最終檢測(cè)結(jié)果應(yīng)以實(shí)際測(cè)定的吸光度，并將對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)換算后計(jì)算得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜籽樣本中AFB1的含量

選取5個(gè)同一批次，不同區(qū)域的樣本，用高效液相色譜法GB 5009.22—2016檢測(cè)其黃曲霉毒素B1含量，結(jié)果如表1所示。所測(cè)定的5個(gè)樣品中，有兩個(gè)油菜籽樣品未檢出AFB1，其他3個(gè)樣品均有檢出，分別為1.14 μg/kg、0.5 μg/kg、0.15 μg/kg，都未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)10 μg/kg。因此，本實(shí)驗(yàn)以未檢出AFB1的油菜籽1為樣本，以空白為基底，加標(biāo)檢驗(yàn)回收。

2.2 提取溶劑的選擇

分別用60%、70%、80%、90%四種濃度的甲醇-水作為提取液對(duì)油菜籽樣本進(jìn)行提取（料液比=1∶5，即5.0 g樣本中加入25.0 mL提取液），1∶4水稀釋，得到AFB1加標(biāo)回收率的結(jié)果如表1所示（每個(gè)加標(biāo)平行測(cè)定3次）。由表1可知，60%甲醇-水提取液對(duì)樣本的提取效果較為理想，回收率為103.2%。考慮高含量有機(jī)試劑對(duì)環(huán)境及操作人員危害性，及高濃度的甲醇可能會(huì)對(duì)抗原和抗體的結(jié)合產(chǎn)生抑制作用，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。綜合選取60%濃度的甲醇-水提取液為最佳提取溶劑。

表1 不同油菜籽樣本中AFB1的含量

2.3 稀釋方法的選擇

查閱文獻(xiàn)可知，提取比例在1∶5時(shí)有足夠的提取效率，且可得到足夠的上清液。固提取比例固定在1∶5，選取不同的稀釋比例及稀釋液進(jìn)行優(yōu)化。由于檢出限不能過(guò)高，選體積比為1∶4、1∶5、1∶9的不同稀釋比例，稀釋液分別采用超純水和0.01 M PBS。結(jié)果如表2所示，當(dāng)提取比例為1∶5，水為稀釋液時(shí)，稀釋比例為1∶4、1∶5、1∶9的3種條件下的回收率分別為104%、110%、96%，都在可接受范圍內(nèi)，且檢出限滿足要求。當(dāng)稀釋比例為1∶4、1∶5、1∶9，稀釋倍數(shù)分別是25倍、30倍、50倍，綜合考慮檢出限及回收率，1∶4的稀釋比例更為合適，該方法的倍數(shù)為25倍。當(dāng)0.01 MPBS作為稀釋液時(shí)，無(wú)論何種稀釋比例，回收均偏高，且出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象，因此確定該稀釋液不適用。

表2 不同提取溶劑下AFB1的加標(biāo)回收率

表3 不同稀釋比例及稀釋液下AFB1的加標(biāo)回收率

2.4 實(shí)際樣本的檢測(cè)

將樣本按曲線點(diǎn)添加0 μg/kg、0.75 μg/kg、3 μg/kg、 12 μg/kg、50 μg/kg AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述60%甲醇1∶5 提取，超純水1∶4稀釋，測(cè)定樣本中AFB1含量，計(jì)算回收率，每個(gè)濃度測(cè)定3次平行。結(jié)果如表4所示，回收率在91%～106%，平均回收率為100%。說(shuō)明60%甲醇1∶5提取，超純水1∶4稀釋測(cè)定樣本中AFB1含量的準(zhǔn)確率高，穩(wěn)定性較好，完全滿足日常監(jiān)測(cè)的需求。

表4 不同添加濃度AFB1的回收率

3 展望

傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫方法，利用抗原和抗體結(jié)合的原理實(shí)現(xiàn)了多種樣本的檢測(cè)，隨著人們研究的深入在逐漸擴(kuò)大，一些特殊樣本的檢測(cè)靈敏度甚至超過(guò)了儀器方法。當(dāng)然在生活水平日益提高的同時(shí)，人們對(duì)食品安全的關(guān)注也越來(lái)越高，對(duì)不同樣本的檢測(cè)方法提出了更高的要求，例如更便捷、更靈敏、更快速等。目前一些技術(shù)在市場(chǎng)上已經(jīng)有所體現(xiàn)，例如微陣列芯片、電化學(xué)傳感器、化學(xué)發(fā)光、微流控、免疫熒光等各種技術(shù)都在食品安全檢測(cè)行業(yè)有應(yīng)用。本文開(kāi)發(fā)的油菜籽方法，在技術(shù)上達(dá)到其中黃曲霉毒素B1檢驗(yàn)的要求，具有高準(zhǔn)確度、高精密度、安全性好、快速的特點(diǎn)。為該類樣本的檢測(cè)提供了一個(gè)前期基礎(chǔ)，希望在未來(lái)能夠?qū)崿F(xiàn)更高效、高靈敏的檢測(cè)。