不同濃度Fe2+與Zn2+對羊草幼苗生長和生理特性的影響

孟令博，趙 曼，亢 燕，祁 智

(內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/牧草與特色作物生物學(xué)教育部重點實驗室，呼和浩特 010031)

鐵(Fe)和鋅(Zn)是植物生長和發(fā)育需求量最大的兩種微量元素，常常是限制農(nóng)作物產(chǎn)量，影響植物營養(yǎng)價值的主要因素。Fe主要參與植物體內(nèi)葉綠素的合成、呼吸作用以及光合作用中電子傳遞的過程[1]；Zn 是植物體內(nèi)眾多酶的組成成分，對蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)等過程具有重要作用[2]。環(huán)境中Fe2+或Zn2+缺乏或過量都會對植物的生長和品質(zhì)造成不利的影響。M’sehli等[3]發(fā)現(xiàn)缺Fe會造成紫花苜蓿(MedicagosativaL.)葉片葉綠素含量、光合電子傳遞速率降低，MDA含量和SOD活性升高，POD、APX活性降低。JIN[4]研究表明較高濃度Fe2+會導(dǎo)致菠菜(SpinaciaoleraceaL.)葉片中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)濃度降低，影響菠菜的品質(zhì)。G?khan[5]發(fā)現(xiàn)缺Zn會造成豆類植物根部伸長率降低、根尖生長減緩、幼葉變黃甚至壞死。另外，據(jù)報道過量Zn會造成植物產(chǎn)量下降和生長遲緩，同時干擾Fe、P、Mg和Mn的吸收[6]。同時由于Zn2+和Fe2+在結(jié)構(gòu)上具有相似性，會存在競爭金屬離子蛋白結(jié)合位點的情況，導(dǎo)致植物體內(nèi)礦質(zhì)元素的失衡，對植物造成損傷。已有研究表明環(huán)境中過量Zn2+會抑制植物對Fe的吸收積累，而補(bǔ)充Fe又能夠減輕鋅過量造成的癥狀，并恢復(fù)植物中Fe元素的含量[7]。因此，植物中鐵鋅的相互作用對鐵鋅穩(wěn)態(tài)有著重要影響，對鐵鋅同時研究有助于了解植物鐵鋅交叉穩(wěn)態(tài)和耐受性。

羊草(Leymuschinensis)又名堿草，是禾本科賴草屬植物，主要分布于歐亞草原，對歐亞草原生產(chǎn)力有重要影響，其生長情況是草原生態(tài)系統(tǒng)和牧草產(chǎn)量的基礎(chǔ)[8]。羊草因其豐富的營養(yǎng)價值而被稱為“牲畜細(xì)糧”，據(jù)劉公社等[9]報道，羊草的粗蛋白質(zhì)含量能占到干物質(zhì)的11%以上，在其分蘗期可以高達(dá)18.53%，而胡蘿卜素含量能達(dá)到49.50～85.87 mg/kg。同時，羊草還具有很強(qiáng)的抗逆性，可以生存在含水量低至3.3%的土壤或pH 8.5～11.5的鹽堿地環(huán)境中，又可以在溫度低至-42 ℃的環(huán)境下安全越冬[10-11]。羊草是內(nèi)蒙古天然草原上的主要建群種，草原土壤類型由東向西依次為黑鈣土、栗鈣土、棕鈣土、灰鈣土等[12]，土壤整體呈堿性，而堿性環(huán)境中能直接被植物根部吸收利用的Fe2+、Zn2+含量很低[13-14]，同時在草原礦區(qū)還存在局部高Fe高Zn的土壤，目前羊草適應(yīng)草原土壤不同鐵鋅濃度環(huán)境的機(jī)制未知，而幼苗階段是植株對環(huán)境較為敏感的時期，幼苗的生長狀況直接關(guān)系到植物成苗的生長和產(chǎn)量。因此，本試驗選擇基于培養(yǎng)基的生長體系為研究手段，以幼苗期的羊草為研究對象，初步探究不同濃度Fe2+、Zn2+處理下羊草幼苗生長和礦質(zhì)元素含量的變化，以及高濃度Fe2+對羊草幼苗抗氧化指標(biāo)以及相關(guān)基因表達(dá)量的變化，為探究羊草鐵、鋅營養(yǎng)機(jī)理，提高羊草的鐵、鋅營養(yǎng)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

參試的羊草種子于2018年9月采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市和林格爾縣。本試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基改良后的全營養(yǎng)培養(yǎng)基[15]，其中Fe2+濃度為0.05 mmol/L，Zn2+濃度為0.015 mmol/L。本研究根據(jù)實驗?zāi)康脑O(shè)計以下兩類實驗。

首先，為了探究不同濃度Fe2+、Zn2+對羊草幼苗生長的影響共設(shè)置如下處理。(1)CK(對照)，全營養(yǎng)培養(yǎng)基；(2)Fe0，其中Fe2+濃度為0，Zn2+濃度為0.015 mmol/L；(3)Fe10，其中Fe2+濃度為0.5 mmol/L(為基礎(chǔ)培養(yǎng)基10倍，下同)，Zn2+濃度為0.015 mmol/L；(4)Fe20，其中Fe2+濃度為1 mmol/L，Zn2+濃度為0.015 mmol/L；(5)Zn0，其中Zn2+濃度為0，F(xiàn)e2+濃度為0.05 mmol/L；(6)Zn10，其中Zn2+濃度為0.15 mmol/L，F(xiàn)e2+濃度為0.05 mmol/L；(7)Zn20，其中Zn2+濃度為0.3 mmol/L，F(xiàn)e2+濃度為0.05 mmol/L。

其次，為了探究在高鐵培養(yǎng)基中補(bǔ)加其他元素對羊草幼苗生長的影響，依據(jù)以上處理的表現(xiàn)，于基本培養(yǎng)基上補(bǔ)加微量元素Zn和大量元素Ca、Mg、K，設(shè)置如下處理。(8)Fe10+Zn10，其中Fe2+濃度為0.5 mmol/L，Zn2+濃度為0.15 mmol/L；(9)CK+ Ca/Mg/K，其中Fe2+濃度為0.05 mmol/L，Ca2+濃度為10 mmol/L，Mg2+濃度為5 mmol/L，K+濃度為20 mmol/L；(10)Fe20+ Ca/Mg/K，其中Fe2+濃度為1 mmol/L，Ca2+濃度為10 mmol/L，Mg2+濃度為5 mmol/L，K+濃度為20 mmol/L。

1.2 羊草幼苗的培養(yǎng)

用純凈水于4 ℃條件下浸泡羊草種子5 d，使用NaClO(西隴科學(xué)股份有限公司)與純凈水(1∶1)的溶液，添加0.5% Triton X-100，室溫?fù)u晃清洗30 min，超凈工作臺內(nèi)使用無菌水洗至清澈，得到無菌羊草種子，以腹線朝上的方式播種到培養(yǎng)基上，22 ℃黑暗處理2 d，豎直光照培養(yǎng)，12 h光照/12 h黑暗，光照強(qiáng)度為220 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)6 d后進(jìn)行生長指標(biāo)和礦質(zhì)元素含量測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長狀況在1.2條件下培養(yǎng)6 d后使用直尺和分析天平(Sartorius BSA124S-CW，德國)采集羊草幼苗根長、葉長、鮮重數(shù)據(jù)，每株幼苗為1次重復(fù)，共40次重復(fù)。

1.3.2 礦質(zhì)元素含量收集生長6 d的羊草幼苗，105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重并記錄，使用高通量組織研磨器(寧波新芝生物 SCIENTZ-192)研磨后，加入5% HNO3，37 ℃振蕩48 h，4 ℃、12 000 r/min離心提取上清液，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES，Ananlytikjena-PQ9000，德國)測定Ca、Fe、Zn、Mg、K含量，每種處理5次重復(fù)。

1.3.3 抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量羊草無菌幼苗在CK培養(yǎng)基生長至根長2～3 cm時，分別轉(zhuǎn)移至Fe20和CK培養(yǎng)基處理48 h，收集緊貼培養(yǎng)基生長的根段，轉(zhuǎn)移至充分預(yù)冷的研缽中并加入提取液，在冰上充分研磨后，4 ℃高速離心，收集待測液，使用試劑盒(購買自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)以分光光度法測定根部過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性以及丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)含量，每種指標(biāo)3次重復(fù)。

1.3.4 基因差異表達(dá)的分析采用與1.3.3相同處理方法獲取根部材料，經(jīng)液氮充分研磨，TRIzol提取液充分混勻，離心提取上清后加入氯仿，再次離心提取上清后加入等體積異丙醇-20 ℃保存[16]。將RNA提取液干冰打包寄送北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，每種處理3次重復(fù)。通過MQA-Fe20和MQA-CK測序結(jié)果中基因表達(dá)量均值的比值(平均變化倍數(shù))來區(qū)分上調(diào)(比值>1)基因和下調(diào)(比值<1)基因，根據(jù)T檢驗結(jié)果保留差異顯著(P<0.05)的基因，再按照平均變化倍數(shù)排序，列出上調(diào)、下調(diào)前20基因進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過StudentT-test進(jìn)行差異顯著性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同F(xiàn)e、Zn濃度條件對羊草幼苗生長的影響

羊草幼苗的根長在缺鐵(Fe0)和高濃度鐵(Fe10、Fe20)處理下分別比對照(CK)極顯著降低17.3%、14.8%、60.8%(P<0.01)，而在缺鋅(Zn0)和高濃度鋅(Zn10、Zn20)處理下均無顯著變化(圖1，A、D)；幼苗葉長在缺鐵和缺鋅處理下均無顯著變化，在高濃度鐵處理下分別比對照極顯著降低18.5%和33.4%，在缺鋅處理下分別極顯著升高9.6%、13.9%(圖1，B、D)；幼苗鮮重也在缺鐵和高濃度鐵處理下均比對照極顯著降低，降幅分別為13.5%、49.4%和58.3%，而在缺鋅處理下比對照顯著降低10.4%(P<0.05)，但在增加鋅處理下無顯著變化(圖1，C)。同時，由圖1，E可以看出，缺鐵對幼苗的根毛發(fā)育無明顯影響，而高濃度鐵處理(Fe10、Fe20)顯著抑制羊草幼苗的根毛發(fā)育，同樣隨濃度的升高抑制作用增強(qiáng)；缺鋅和高濃度鋅對羊草幼苗根毛發(fā)育均無明顯影響?？梢?，羊草幼苗生長發(fā)育在缺鐵和高濃度鐵條件下均受到顯著抑制作用，且抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)，而在缺鋅和高濃度鋅條件下沒有受到顯著影響。

處理間差異顯著性檢測采用Student T-test分析，*、**、***分別表示處理與對照間在0.05、0.01和0.001水平存在顯著性差異。下圖同圖1 不同濃度Fe2+、Zn2+培養(yǎng)基中羊草幼苗生長指標(biāo)和根毛形態(tài)The significance analysis between control and treatments conducted by Student T-test, while *, ** and *** indicate significant difference between control and treatment at 0.05, 0.01 and 0.001 levels, respectively. The same as belowFig.1 The growth phenotypes and root hair morphology of L. chinensis seedlings in medium with different concentrations of Fe2+ and Zn2+

2.2 不同F(xiàn)e、Zn濃度條件對羊草幼苗礦質(zhì)元素含量的影響

羊草幼苗Ca含量在缺鐵、缺鋅及高濃度鋅(Zn20)處理下均與對照無顯著差異，在高濃度鐵(Fe10、Fe20)處理下分別顯著降低40.9%和52.0%，在高濃度鋅(Zn10)處理下顯著增加17.0%，說明高濃度Fe2+顯著抑制羊草幼苗Ca含量積累，且抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)，高濃度Zn有顯著促進(jìn)Ca含量積累的趨勢(圖2，A)。同時，羊草幼苗Fe含量在缺鋅、高濃度鐵(Fe10、Fe20)處理培養(yǎng)下得到顯著促進(jìn)，分別比對照顯著增加15.2%、188.3%、395.2%，在缺鐵處理培養(yǎng)下顯著降低23.2%，F(xiàn)e元素積累受到顯著抑制，即隨著培養(yǎng)基中Fe2+濃度的升高，羊草幼苗體內(nèi)的Fe元素含量逐漸升高(圖2，B)。羊草幼苗Zn含量在缺鐵、高濃度鋅(Zn10、Zn20)培養(yǎng)下分別比對照顯著增加156.4%、538.7%、915.1%，促進(jìn)了Zn積累，而在缺鋅、高濃度鐵(Fe10、Fe20)培養(yǎng)下受到顯著抑制，分別比對照顯著降低34.5%、29%、34.5%(圖2，C)。羊草幼苗Mg含量在缺Fe和高濃度鋅(Zn10)培養(yǎng)下分別比對照顯著增加10.2%、15.4%，積累量得到顯著促進(jìn)，在高濃度鐵(Fe10、Fe20)培養(yǎng)下分別比對照顯著降低17%、37%， Mg元素積累受到顯著抑制(圖2，D)。另外，羊草幼苗K含量僅在高濃度鐵(Fe10、Fe20)培養(yǎng)下受到顯著抑制，分別比對照顯著降低43.9%和65.6%，其余處理均無顯著變化(圖2，E)。以上結(jié)果說明含高濃度Fe2+培養(yǎng)基顯著抑制羊草幼苗對Ca、Zn、Mg、K元素的吸收積累，顯著促進(jìn)Fe的吸收積累，且羊草對Fe和Zn的吸收有明顯的拮抗作用。

2.3 高濃度Fe2+條件下補(bǔ)加其他離子對羊草幼苗生長的影響

以上實驗結(jié)果顯示，高濃度鐵(Fe10、Fe20)培養(yǎng)基顯著抑制羊草幼苗的根葉生長、根毛發(fā)育以及Ca、Zn、Mg、K元素積累，現(xiàn)進(jìn)一步探究是否可以通過補(bǔ)加Ca、Zn、Mg、K抑制元素來恢復(fù)高濃度鐵對羊草生長的抑制。

首先，在Fe10培養(yǎng)基中補(bǔ)加0.15 mmol/L Zn2+(Fe10+Zn10)后，羊草幼苗的根長、葉長和鮮重分別比對照顯著降低19.6%、17.9%、26.1%，根毛發(fā)育也不及對照和Zn10培養(yǎng)基，但均與Fe10培養(yǎng)無顯著差異，即在Fe10培養(yǎng)基中補(bǔ)加0.15 mmol/L Zn2+無法恢復(fù)高濃度Fe對幼苗生長的抑制作用(圖3)。

其次，在Fe20培養(yǎng)基中補(bǔ)加10 mmol/L Ca2+、5 mmol/L Mg2+、20 mmol/L K+(Fe20+ Ca/Mg/K)后，羊草幼苗根長、葉長、鮮重分別比對照顯著降低60.5%、43.1%、50%，根毛發(fā)育也明顯不及對照，所有指標(biāo)也不同程度地低于Fe20培養(yǎng)基；在對照培養(yǎng)基中添加同樣濃度的Ca、Mg、K元素，羊草幼苗生長和根毛發(fā)育也顯著比對照差，但明顯優(yōu)于Fe20培養(yǎng)基(圖4)?？梢姡囵B(yǎng)基中添加額外的Ca、Mg、K元素不僅明顯抑制了羊草幼苗生長，也無法恢復(fù)高濃度鐵(Fe20)對羊草幼苗生長的抑制作用。

圖2 不同濃度Fe2+、Zn2+培養(yǎng)基中羊草幼苗礦質(zhì)元素含量Fig.2 The element contents of L. chinensis seedlings in medium with different concentrations of Fe2+ and Zn2+

2.4 高濃度Fe2+對羊草幼苗根部氧化還原相關(guān)酶活性和化合物含量的影響

以上實驗結(jié)果表明高濃度Fe2+(Fe20)對羊草幼苗生長發(fā)育以及礦質(zhì)元素含量均有顯著的抑制作用，而植物在逆境脅迫下會產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的過氧化，嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致植株的死亡。因此本實驗針對高濃度Fe2+(Fe20)處理下羊草幼苗根部抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)情況進(jìn)行探究。表1顯示：高濃度Fe2+處理羊草幼苗48 h后，其根部過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性顯著上升，增幅分別為13.5%、27%、44.4%、32.9%、34.2%，而其根部丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)含量也顯著上升，增幅分別達(dá)到62.7%、46%、114.8%。這說明環(huán)境中高濃度Fe2+脅迫雖然能誘導(dǎo)羊草幼苗根部抗氧化系統(tǒng)活性和抗氧化物質(zhì)含量顯著增加，但并不能消除高鐵脅迫的影響，仍致使根部遭受到嚴(yán)重的過氧化傷害。

圖3 Fe10+Zn10培養(yǎng)基中羊草幼苗生長指標(biāo)和典型苗根毛形態(tài)Fig.3 The growth and typical root hair morphology of L. chinensis seedlings cultured in Fe10 +Zn10

圖4 Fe20+Ca/Mg/K培養(yǎng)基中羊草幼苗生長指標(biāo)和典型苗根毛形態(tài)Fig.4 The growth and typical root hair morphology of L. chinensis seedlings cultured in Fe20 +Ca/Mg/K

2.5 高濃度Fe2+對羊草幼苗根部相關(guān)基因表達(dá)量的影響

為進(jìn)一步探究高濃度Fe2+(Fe20)處理下羊草幼苗根部相關(guān)基因的響應(yīng)情況，對轉(zhuǎn)錄組測序差異表達(dá)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，根據(jù)基因表達(dá)量變化倍數(shù)列出表達(dá)量顯著上調(diào)和下調(diào)排名前20的基因(表2和表3)。其中，表達(dá)量顯著上調(diào)基因中有2條植物類萌發(fā)素蛋白基因，均上調(diào)30倍以上；表達(dá)量顯著下調(diào)基因中主要為煙酰胺合成酶基因和過氧化物酶基因，均至少下調(diào)10倍以上。

表1 高濃度Fe2+(Fe20)處理羊草幼苗48 h后根部氧化還原相關(guān)酶活性和化合物含量的變化

表2 高濃度Fe2+(Fe20)處理羊草幼苗48 h根部表達(dá)量上調(diào)前20的基因

表3 高濃度Fe2+(Fe20)處理羊草幼苗48 h表達(dá)量下調(diào)前20的基因

3 討 論

3.1 羊草幼苗生長和礦質(zhì)元素含量對不同濃度Fe2+、Zn2+的響應(yīng)

本研究發(fā)現(xiàn)高濃度Fe2+顯著抑制羊草幼苗根葉生長發(fā)育以及Ca、Zn、Mg、K元素積累，這與趙燕等[17]報道的過量Fe2+會導(dǎo)致植株中Ca、P、K、Zn、Mg、Mn等營養(yǎng)元素的嚴(yán)重缺乏，植株生長發(fā)育、株高、根系長度、干物質(zhì)量等受到抑制的現(xiàn)象相同。表明高濃度Fe2+脅迫是多種礦質(zhì)元素失衡的過程，造成植物其他必需營養(yǎng)元素的不足，進(jìn)一步加劇了脅迫對植物的毒害，使得生長發(fā)育過程無法正常進(jìn)行，這是Fe2+過量導(dǎo)致羊草幼苗根葉生長、根毛發(fā)育嚴(yán)重受阻的重要原因。

本試驗中Zn10、Zn20處理均表現(xiàn)出促進(jìn)羊草幼苗葉片生長的趨勢。而鄒文桐[18]、俞明惠等[19]的研究都發(fā)現(xiàn)隨著環(huán)境中Zn2+濃度的升高，植物生長都表現(xiàn)出先促進(jìn)再抑制的趨勢，這與本試驗結(jié)果不一致，這可能是因為羊草幼苗階段對較高濃度的Zn2+有一定的耐受性，所以并未表現(xiàn)出抑制作用。段曉暉的研究表明低濃度Zn緩解了Fe處理對植物幼苗根的毒害作用，而高濃度Zn會與Fe協(xié)同作用，使毒害作用加強(qiáng)[20]。這與本試驗中補(bǔ)加高濃度的Zn2+無法恢復(fù)高濃度Fe2+對羊草幼苗抑制作用結(jié)果相同，同樣這可能也是補(bǔ)加Ca、Mg、K無法恢復(fù)抑制作用的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)在缺Fe2+(Fe0)培養(yǎng)下羊草幼苗體內(nèi)Zn元素含量顯著升高，在缺Zn2+(Zn0)培養(yǎng)下幼苗體內(nèi)Fe元素含量顯著升高，這是由于Fe2+和Zn2+有著相似的離子半徑，二者在轉(zhuǎn)運載體上有著相同的轉(zhuǎn)運位點，從而在轉(zhuǎn)運中形成競爭[21]。在轉(zhuǎn)運中有競爭關(guān)系的兩種離子其中一種缺乏后，從而促進(jìn)羊草幼苗轉(zhuǎn)運吸收另一種。

3.2 羊草幼苗根部抗氧化防御系統(tǒng)對高濃度Fe2+的響應(yīng)

植物作為好氧生物，體內(nèi)有眾多氧氣參與的反應(yīng)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生是不可避免的。正常情況下，植物體內(nèi)的ROS處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)ROS的產(chǎn)生與清除失衡時，就會對植物產(chǎn)生氧化脅迫，造成損傷，嚴(yán)重時還會引起細(xì)胞甚至植物的死亡[22]。根是植物從環(huán)境中吸收養(yǎng)分的重要器官，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變不適宜植物生長，根的生理響應(yīng)往往最直觀和迅速。本試驗中羊草幼苗根部經(jīng)高濃度Fe2+處理48 h后，根部 POD、SOD、CAT活性和MDA含量顯著升高，另外抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中AsA、GSH含量和GR、APX活性也顯著升高。當(dāng)環(huán)境中存在高濃度Fe2+時，植物吸收入體內(nèi)的過量Fe可以通過Fenton反應(yīng)等生命活動產(chǎn)生大量的ROS[23]，ROS含量的升高，導(dǎo)致羊草幼苗根部細(xì)胞質(zhì)膜過氧化程度加深，MDA含量升高，同時誘導(dǎo)羊草體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)做出響應(yīng)，POD、SOD、CAT活性顯著升高，提高ROS的清除能力，減少自身損傷；植物體內(nèi)另一條ROS清除途徑抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)同樣做出響應(yīng)，GR、APX活性和GSH、AsA含量升高，其中AsA含量的升高表明羊草幼苗整體抗氧化能力并未衰退[24]?；谝陨辖Y(jié)果證實高濃度Fe2+對羊草幼苗造成氧化脅迫，產(chǎn)生大量的ROS物質(zhì)，為應(yīng)對脅迫羊草體內(nèi)酶促反應(yīng)防御系統(tǒng)中關(guān)鍵酶活性升高，非酶類防御系統(tǒng)中抗氧化化合物含量升高，大大提升了羊草體內(nèi)ROS的清除能力，實現(xiàn)過量Fe2+環(huán)境下的防御響應(yīng)。

3.3 羊草幼苗根部脅迫相關(guān)基因表達(dá)對高濃度Fe2+的響應(yīng)

植物在遭受逆境脅迫下，會通過調(diào)節(jié)體內(nèi)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量來控制相關(guān)蛋白的合成，從而使機(jī)體能更快地適應(yīng)脅迫環(huán)境。王靜等[25]研究表明植株在受到脅迫后，POD表達(dá)量在6 h達(dá)到最大，并在24 h后表達(dá)量低于對照組，而本研究中高濃度Fe2+處理羊草幼苗48 h后，可能由于處理時間較長，POD表達(dá)量顯著下調(diào)。Douchkov等[26]發(fā)現(xiàn)煙酰胺對植物體內(nèi)金屬離子的吸收和穩(wěn)態(tài)的維持起著重要的作用，在煙草(NicotianatabacumL.)中過表達(dá)擬南芥(Arabidopsisthaliana)的煙酰胺合成酶(NAS)基因，可以提高葉片中Fe元素含量。本試驗發(fā)現(xiàn)在高濃度Fe2+處理下，羊草受到了過量Fe的毒害，為維持體內(nèi)Fe穩(wěn)態(tài)，下調(diào)了NAS表達(dá)量，減少煙酰胺的合成，從而降低植株對環(huán)境中Fe的吸收，保護(hù)羊草幼苗適應(yīng)脅迫條件。另外，類萌發(fā)素蛋白(GLPs)是廣泛存在于各種陸生植物中的植物糖蛋白，許多定位于細(xì)胞壁，是植物在脅迫響應(yīng)下細(xì)胞壁強(qiáng)化的輔助因子[27]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時，GLPs能夠通過發(fā)揮其結(jié)構(gòu)蛋白的功能，來幫助植物度過不利的環(huán)境條件，降低脅迫對植物的傷害[28]。本試驗中羊草幼苗在高濃度Fe2+處理后，根部通過上調(diào)GLPs的表達(dá)量，提高自身在高濃度Fe2+下的適應(yīng)性，降低受損傷的程度。

4 結(jié) 論

本試驗初步研究了不同鐵鋅濃度對羊草幼苗生長和礦質(zhì)元素含量的影響，發(fā)現(xiàn)缺Zn2+(Zn0)和高濃度Zn2+(Zn20)處理下對生長無明顯影響；缺Fe2+(Fe0)和高濃度Fe2+(Fe20)對生長均有抑制作用，尤其是高濃度Fe2+培養(yǎng)下對羊草幼苗根葉生長、根毛發(fā)育以及Ca、Zn、Mg、K元素含量有顯著的抑制，表明羊草幼苗對Zn2+濃度變化不敏感，而對Fe2+濃度變化敏感。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高濃度Fe2+(Fe20)會導(dǎo)致羊草幼苗根中POD、SOD、CAT、APX、GR活性和MDA、AsA、GSH含量顯著升高；NAS、POD表達(dá)量顯著下調(diào)，GLPs表達(dá)量顯著上調(diào)。從而證實高濃度Fe2+會對羊草幼苗造成嚴(yán)重的氧化脅迫。本研究結(jié)果填補(bǔ)了羊草鐵鋅脅迫方面研究的空白，可為了解羊草及相關(guān)植物對鐵鋅的適應(yīng)特性提供依據(jù)，為提高羊草的鐵鋅營養(yǎng)利用提供重要參考。