p16/Ki-67雙染在細(xì)胞學(xué)結(jié)果異常人群中的檢測(cè)及其對(duì)宮頸CIN2+病變的診斷價(jià)值

徐燕寧 陳凌 申彥 張小晶 張新瑩 劉易欣

天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院南開(kāi)大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院病理科，天津人類發(fā)育與生殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室300100

0 引 言

盡管現(xiàn)行的宮頸癌篩查手段越來(lái)越快速有效，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）疫苗也已問(wèn)世，但宮頸癌的發(fā)病率和病死率仍呈上升趨勢(shì)。全球?qū)m頸癌的發(fā)病率和病死率占女性惡性腫瘤第4位，每年全球新發(fā)病例約57萬(wàn)例，死亡病例約31萬(wàn)例[1]。在中國(guó)，這些數(shù)據(jù)同樣一直呈上升態(tài)勢(shì)。2015年，我國(guó)宮頸癌新發(fā)病例為11.1萬(wàn)例，死亡病例為3.4萬(wàn)例[2]。

目前，我國(guó)宮頸癌的篩查方法主要包括：宮頸細(xì)胞學(xué)篩查、高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus,HR-HPV）檢測(cè)、宮頸細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HRHPV篩查。細(xì)胞學(xué)篩查歷史悠久，在人類宮頸癌的預(yù)防史中發(fā)揮了重要作用，但其靈敏度低（僅為50%～70%）、重復(fù)性差[3]，一些不確定陽(yáng)性診斷如非典型鱗狀細(xì)胞，意義不明確（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）的診斷重復(fù)性甚至低于50%[4-5]。HR-HPV檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用于宮頸癌的初篩及分流檢測(cè)，可有效降低宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）Ⅱ級(jí)及以上病變（CIN2+）的漏診率。但遺憾的是目前的HRHPV檢測(cè)方法尚無(wú)法區(qū)分HPV感染是一過(guò)性還是持續(xù)性感染，其特異度較低，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不滿意，導(dǎo)致陰道鏡轉(zhuǎn)診率增加。目前認(rèn)為聯(lián)合篩查是最佳的篩查方案[6]，對(duì)30歲的女性應(yīng)用聯(lián)合篩查方案，不但可提高檢出率，減少陰道鏡轉(zhuǎn)診率，還可將篩查的間隔時(shí)間延長(zhǎng)為3年。但聯(lián)合篩查價(jià)格昂貴，難以在我國(guó)廣大的經(jīng)濟(jì)及醫(yī)療水平欠發(fā)達(dá)地區(qū)有效開(kāi)展。

隨著對(duì)HPV相關(guān)宮頸癌分子發(fā)病機(jī)制的深入了解，研究者發(fā)現(xiàn)檢測(cè)相關(guān)的生物標(biāo)志物可用來(lái)彌補(bǔ)傳統(tǒng)篩查方式的不足，提高宮頸癌及癌前病變的篩查效率。有大數(shù)據(jù)前瞻性研究結(jié)果顯示，p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染（p16/Ki-67雙染）檢測(cè)CIN2+的靈敏度與HR-HPV檢測(cè)相似，但特異度高于HR-HPV檢測(cè)[7-8]。

為了分析p16/Ki-67雙染的具體應(yīng)用價(jià)值，本研究回顧性分析了天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院南開(kāi)大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院的225例液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（thinprep cytologic test,TCT）結(jié)果異常（≥ASC-US）婦女的臨床病理資料，對(duì)殘余標(biāo)本進(jìn)行p16/Ki-67雙染，并與HR-HPV檢測(cè)及組織病理學(xué)結(jié)果比較，探討p16/Ki-67雙染在細(xì)胞學(xué)結(jié)果異常人群中的檢測(cè)效果及其對(duì)CIN2+病變的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年12月至2019年12月在天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院南開(kāi)大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院就診的TCT結(jié)果為≥ASC-US的患者225例，年齡范圍20～72歲，年齡（39.4±9.7）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①在天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院南開(kāi)大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院同時(shí)行HR-HPV檢測(cè)。②均有活檢組織病理結(jié)果。③患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于妊娠期及哺乳期。②有宮頸物理和手術(shù)治療史。本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

p16/Ki-67檢測(cè)試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），ThinPrep 2000液基薄層細(xì)胞學(xué)制片機(jī)（美國(guó)Hologic公司），Cobas4800 HPV檢測(cè)系統(tǒng)（瑞士Roche公司）。

1.2.2 p16/Ki-67雙染

將TCT殘余的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本程序化制片后置于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液中固定30 min，然后進(jìn)行抗原修復(fù)并阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。采用p16/Ki-67檢測(cè)試劑盒雙染，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將宮頸細(xì)胞薄片依次與一抗、二抗孵育，再用二氨基聯(lián)苯胺顯色及蘇木精對(duì)比染色，封片后于顯微鏡下判讀。雙染結(jié)果由天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院南開(kāi)大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院細(xì)胞學(xué)醫(yī)師評(píng)估，醫(yī)師在判讀時(shí)不知曉患者的TCT和HR-HPV檢測(cè)結(jié)果。鏡下見(jiàn)≥1個(gè)細(xì)胞的胞質(zhì)染為紅色（Ki-67)，同時(shí)這些細(xì)胞位于同一顯微層面的胞核染為紅褐色或棕黃色（p16）判讀為陽(yáng)性。225例標(biāo)本中有12例標(biāo)本因細(xì)胞量不足無(wú)法進(jìn)行p16/Ki-67診斷而被排除，最終有效標(biāo)本數(shù)為213例。

1.2.3 HR-HPV檢測(cè)

1.2.4 細(xì)胞學(xué)與組織病理學(xué)評(píng)估

所有納入此研究病例的細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)結(jié)果均由天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院南開(kāi)大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院病理科經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師評(píng)估。TCT結(jié)果依據(jù)2015年Bethesda分類系統(tǒng)進(jìn)行報(bào)告，其中鱗狀細(xì)胞類病變包括ASC-US、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、LSIL+非典型鱗狀細(xì)胞，不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（atypical squamous cells cannot except high-grade squamous intraepithelial lesion,ASC-H）、ASC-H、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-gradesquamousintraepithelial lesion,HSIL）、鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma,SCC），將診斷結(jié)果中≥ASC-US界定為細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性。組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2014年世界衛(wèi)生組織女性生殖器官腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，分為：正?；蜓装Y反應(yīng)、CINⅠ～Ⅲ級(jí)、陰道上皮內(nèi)瘤變（vaginal intraepithelial neoplasia,VaIN）Ⅱ～Ⅲ級(jí)、原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AI S）、S CC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分比或構(gòu)成比描述，組間差異性比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，組內(nèi)比較采用McNemar檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同級(jí)別異常TCT診斷中p16/Ki-67雙染和HR-HPV檢測(cè)的陽(yáng)性率

由表1可知，隨著TCT診斷級(jí)別的上升，p16/Ki-67雙染的陽(yáng)性率呈上升趨勢(shì)；p16/Ki-67在TCT診 斷 為ASC-US、LSIL、LSIL+ASC-H、ASC-H、HSIL、SCC患者中的陽(yáng)性率分別為52.3%、40.0%、52.9%、60.7%、86.1%、100.0%。而HR-HPV檢測(cè)在各個(gè)級(jí)別的異常TCT診斷中的陽(yáng)性率均很高，達(dá)81.8%～100.0%。

表1 不同級(jí)別異常TCT診斷中p16/Ki-67雙染及HR-HPV檢測(cè)的陽(yáng)性率[例數(shù)（%）]

2.2 不同級(jí)別組織病理學(xué)診斷中p16/Ki-67雙染和HR-HPV檢測(cè)的陽(yáng)性率

由表2可知，p16/Ki-67雙染陽(yáng)性率隨著宮頸組織病理學(xué)病變程度的加重而呈升高趨勢(shì)；p16/Ki-67雙染在組織病理學(xué)診斷為正常或炎癥反應(yīng)患者中的陽(yáng)性率為33.8%，在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ患者中的陽(yáng)性率分別為54.1%、87.1%、89.7%，在SCC患者中的陽(yáng)性率為94.1%，在VaINⅡ～Ⅲ和AIS患者中的陽(yáng)性率均為100.0%。而HR-HPV檢測(cè)在各類異常組織病理學(xué)診斷中的陽(yáng)性率均很高（94.1%～100.0%），其在正?；蜓装Y反應(yīng)患者中的陽(yáng)性率也高達(dá)69.2%。

表2 不同級(jí)別組織病理學(xué)診斷中p16/Ki-67雙染及HR-HPV檢測(cè)的陽(yáng)性率[例數(shù)（%）]

2.3 p16/Ki-67雙染和HR-HPV檢測(cè)對(duì)CIN2+/CIN3+檢出能力的比較

分別以組織病理學(xué)診斷CIN2+與CINⅢ級(jí)及以上病變（CIN3+）作為篩查終點(diǎn)，評(píng)價(jià)p16/Ki-67雙染和HR-HPV檢測(cè)這兩種方法的診斷能力。McNemar檢驗(yàn)結(jié)果顯示，p16/Ki-67雙染診斷CIN2+的靈敏度略低于HR-HPV檢測(cè)（P<0.05），但特異度明顯高于HR-HPV檢測(cè)（P<0.001）（表3）。進(jìn)一步使用受試者工作特征曲線分析中的約登指數(shù)綜合評(píng)估上述兩種檢測(cè)方法對(duì)CIN2+的檢出能力，結(jié)果顯示p16/Ki-67雙染和HR-HPV檢測(cè)的約登指數(shù)分別為0.489和0.198，表明綜合評(píng)估p16/Ki-67雙染對(duì)CIN2+的檢出能力要優(yōu)于HR-HPV檢測(cè)。此外，p16/Ki-67雙染診斷CIN3+的靈敏度與HR-HPV檢測(cè)相當(dāng)（P>0.05），但特異度明顯高于HR-HPV檢測(cè)（P<0.001）（表3）。

表3 p16/Ki-67雙染和HR-HPV檢測(cè)對(duì)CIN2+和CIN3+檢出能力的比較（%）

2.4 p16/Ki-67雙染和HR-HPV檢測(cè)在ASC-US和LSIL患者中對(duì)CIN2+檢出能力的比較

McNemar檢驗(yàn)結(jié)果顯示，44例ASC-US患者中p16/Ki-67雙染檢出CIN2+的靈敏度與HR-HPV檢測(cè)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但p16/Ki-67雙染的特異度高于HR-HPV檢測(cè)（P<0.001）；50例LSIL患者中p16/Ki-67雙染檢出CIN2+的靈敏度略低于HR-HPV檢測(cè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但p16/Ki-67雙染的特異度明顯高于HR-HPV檢測(cè)（P<0.001）（表4）。

表4 p16/Ki-67雙染和HR-HPV檢測(cè)在ASC-US及LSIL患者中對(duì)CIN2+檢出能力的比較（%）

3 討論與結(jié)論

目前，宮頸癌篩查方式中的宮頸細(xì)胞學(xué)篩查及HR-HPV檢測(cè)均存在局限性[10]，兩者聯(lián)合篩查雖可避免各自的局限性，但因價(jià)格昂貴難以在欠發(fā)達(dá)和貧困地區(qū)開(kāi)展。因此亟需從宮頸癌前病變和宮頸癌的生物學(xué)標(biāo)志物入手[11-12]，探究更為簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)有效的篩查和協(xié)助分流管理的方法。

p16/Ki-67雙染的基本原理如下：在真核細(xì)胞中，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)主要位于G1-S期和G2-M期。G1-S期的調(diào)節(jié)主要通過(guò)細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）-周 期 蛋 白 依 賴 性 激 酶4/6（cyclin-dependent kinases 4/6，CDK4/6）-pRb-E2F和p14-MDM2-p53這兩條途徑來(lái)完成。p16通過(guò)前一條途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞周期的作用。正常情況下，cyclin D1與CDK4/6在G1期結(jié)合激活，激活后的cyclin D1-CDK4/6復(fù)合物使pRb-E2F復(fù)合體中的pRb發(fā)生磷酸化，從而失去對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制能力進(jìn)而促使細(xì)胞進(jìn)入S期。p16在cyclin D1-CDK4/6-pRb-E2F途徑中擔(dān)負(fù)著負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，其通過(guò)抑制CDK4/6的活性，使未發(fā)生磷酸化的pRb增多而抑制細(xì)胞增殖。90%以上的宮頸癌歸因于持續(xù)性HR-HPV感染，其導(dǎo)致HR-HPV致癌基因產(chǎn)生E6、E7蛋白，E6、E7蛋白與pRb蛋白結(jié)合后使得p16失去了負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用而在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中過(guò)表達(dá)。因此，目前p16免疫組織化學(xué)染色被廣泛應(yīng)用于宮頸癌前病變的輔助診斷中。而Ki-67是一種反應(yīng)細(xì)胞增殖活性的增殖細(xì)胞核抗原，因此p16與Ki-67不可能同時(shí)在一個(gè)正常細(xì)胞中表達(dá)。若在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)到這兩種抗原，說(shuō)明該細(xì)胞的細(xì)胞周期失去了調(diào)控，發(fā)生癌變的機(jī)率大大增加[13-14]。

本研究中p16/Ki-67雙染對(duì)研究對(duì)象CIN2+檢出的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值與國(guó)內(nèi)[15]和國(guó)際上的多個(gè)研究報(bào)道的結(jié)果相近。在一篇包含20項(xiàng)研究的回顧性分析中，研究者統(tǒng)計(jì)了p16/Ki-67雙染檢測(cè)CIN2+的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值范圍分別為50.0%～100.0%、39.0%～90.4%、11.1%～92.3%和86.7%～100.0%[11]。不同研究中觀察到p16/Ki-67雙染的診斷性能存在明顯差別，分析其差異是由年齡、種族、細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法及宮頸病變類型等人群背景的差異所致。但鑒于這些研究所觀察到受試者工作特征曲線下面積較大以及陰性預(yù)測(cè)值較高，p16/Ki-67雙染檢測(cè)CIN2+的能力仍是值得肯定的[11]。只是在如何應(yīng)用才能使其發(fā)揮最佳診斷能力方面，還需結(jié)合具體應(yīng)用情況來(lái)分析決定。從表1中不難發(fā)現(xiàn)，研究對(duì)象中各類TCT結(jié)果異常患者的HR-HPV陽(yáng)性率均很高（≥81.8%），而p16/Ki-67雙染具有較高的特異度和陰性預(yù)測(cè)值，故與HR-HPV檢測(cè)相比p16/Ki-67雙染對(duì)于檢出CIN2+及CIN3+病變具有更佳的診斷效果。

另外本研究中包含了一部分TCT結(jié)果診斷為ASC-US和LSIL的輕度異常病例。盡管ASC-US和LSIL 5年發(fā)生CIN3+的風(fēng)險(xiǎn)分別僅為2.6%和5.2%[16]，但隨著篩查能力的提升，希望能將ASC-US中遺漏的和LISL中潛在患有HSIL的這部分高危人群篩選出來(lái)。本研究中p16/Ki-67雙染在ASC-US和LSIL患者中的陽(yáng)性率分別為52.3%和40.0%，而HR-HPV檢測(cè)在這兩類患者中的陽(yáng)性率分別為81.8%和96.0%。與HR-HPV檢測(cè)相比，p16/Ki-67雙染對(duì)于檢出ASC-US和LSIL患者中CIN2+病變具有相當(dāng)?shù)撵`敏度和更高的特異度，因此通過(guò)p16/Ki-67雙染對(duì)這兩類輕微病變患者進(jìn)行分流可大幅降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率。但因本研究涵蓋的病例數(shù)量有限，結(jié)果可能具有局限性，在今后的工作中尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證p16/Ki-67雙染在ASC-US和LSIL患者分流管理中的應(yīng)用價(jià)值。

總之，p16/Ki-67雙染結(jié)果判讀簡(jiǎn)單、客觀，相關(guān)人員只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的培訓(xùn)即可掌握。p16/Ki-67雙染用于TCT結(jié)果異常人群的分流具有優(yōu)于HR-HPV檢測(cè)的特異度以及與HR-HPV檢測(cè)相近的靈敏度特性。p16/Ki-67雙染檢測(cè)可更有效地對(duì)ASC-US及LSIL患者進(jìn)行分流管理，大幅降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突