8份綠穗莧種子萌發(fā)期耐鹽堿性綜合評(píng)價(jià)

朱依晗， 劉寧芳， 胡龍興， 徐 倩

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系， 湖南 長(zhǎng)沙 410128)

我國(guó)鹽堿地面積約有9 913萬(wàn)hm2，是我國(guó)重要的后備土地資源，改良和充分利用鹽堿土對(duì)糧食生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義[1]。篩選和培育耐鹽植物品種，是土壤鹽堿化改良和利用的主要途徑[2]，而對(duì)植物進(jìn)行耐鹽堿性評(píng)價(jià)，是植物耐鹽堿育種和種質(zhì)資源創(chuàng)新的基礎(chǔ)[3]。

鹽堿脅迫作為限制植物生長(zhǎng)的重要環(huán)境因素，對(duì)植物從種子萌發(fā)到開(kāi)花結(jié)實(shí)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程均有諸多影響，會(huì)造成植物發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率低、發(fā)芽延遲、幼苗死亡率高、葉綠素含量減少和光合性能降低等影響[4-5]。種子萌發(fā)期和胚根胚芽伸長(zhǎng)期是對(duì)鹽堿脅迫反應(yīng)最為敏感的時(shí)期，因此采用種子萌發(fā)試驗(yàn)進(jìn)行種質(zhì)資源的耐鹽堿性篩選與評(píng)價(jià)是植物抗逆性研究中一種常用的方法[6]。鹽堿脅迫包括中性鹽和堿性鹽脅迫兩大類，目前關(guān)于中性鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響研究較多[7-8]，而堿性鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響研究相對(duì)較少，本研究采用NaHCO3溶液模擬堿性鹽脅迫，探究鹽堿脅迫對(duì)綠穗莧(Amaranthushybriaus)種子萌發(fā)的影響以及不同基因型綠穗莧種質(zhì)資源之間耐鹽堿性的差異，從而為耐鹽堿綠穗莧品種的選育和種植提供理論基礎(chǔ)。

綠穗莧為莧科莧屬一年生糧食、飼料、蔬菜、綠肥、醫(yī)藥等多種用途的新型農(nóng)作物。綠穗莧根系發(fā)達(dá)，主根入土深度達(dá)2.45 m以上，側(cè)根數(shù)量多，利用土壤中的水分、養(yǎng)分的能力強(qiáng)，對(duì)干旱、瘠薄、鹽堿等逆境脅迫具有較強(qiáng)的耐受性，可用于改良各種不良土壤，也可用于防治水土流失、治理土地沙化[4,9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，不同的莧屬植物種質(zhì)資源對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)不同。因此，本試驗(yàn)選取8份不同來(lái)源的綠穗莧種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)期耐鹽性鑒定，以期篩選出耐鹽堿種質(zhì)，為綠穗莧的耐鹽機(jī)理和后期的耐鹽堿綠穗莧新品種選育與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試的8份綠穗莧種質(zhì)資源均來(lái)自美國(guó)農(nóng)業(yè)部種質(zhì)資源庫(kù)(表1)。NaHCO3溶液濃度篩選試驗(yàn)選用的植物材料為本地籽粒莧種質(zhì)資源‘1378’，保存在本課題組種質(zhì)資源圃。

表1 8份綠穗莧種質(zhì)資源信息Table 1 Basic information for the 8 A. hybridus germplasm resources

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

為了篩選合適的鹽處理濃度，首先選用本地籽粒莧種質(zhì)資源‘1378’進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。試驗(yàn)采用玻璃培養(yǎng)皿(9 cm)進(jìn)行，每皿中鋪入兩張大小相同的濾紙，分別加入2 mL濃度為0 mmol·L-1(CK，pH=6.80)，40 mmol·L-1(pH=8.54)，80 mmol·L-1(pH=8.42)，120 mmol·L-1(pH=8.31)，160 mmol·L-1(pH=8.26)，200 mmol· L-1(pH=8.17)的NaHCO3溶液，選取完整、飽滿且無(wú)病蟲(chóng)害的種子，用5%的NaClO溶液消毒5 min，再用蒸餾水反復(fù)沖洗后均勻播撒在濾紙上，每皿30粒，置于25℃/20℃(光照/黑暗，14 h/10 h)的人工氣候室中培養(yǎng)，各處理均重復(fù)4次。

根據(jù)不同NaHCO3濃度下‘1378’的種子萌發(fā)情況，確定合適的鹽堿脅迫處理濃度，對(duì)8份不同來(lái)源的綠穗莧種質(zhì)資源進(jìn)行耐鹽堿性篩選與評(píng)價(jià)，處理方式同上。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

種子萌發(fā)過(guò)程中，每天同一時(shí)間采用稱重法進(jìn)行補(bǔ)水，每隔24 h記錄一次種子發(fā)芽情況。于第4天計(jì)算種子發(fā)芽勢(shì)，待所有種子萌發(fā)結(jié)束時(shí)計(jì)算種子發(fā)芽率，萌發(fā)結(jié)束的標(biāo)準(zhǔn)為種子3天內(nèi)不再有新的發(fā)芽數(shù)[11]。種子萌發(fā)結(jié)束后從每個(gè)處理中隨機(jī)選取10株苗，用精度為0.01 cm的游標(biāo)卡尺對(duì)幼苗的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)定指標(biāo)參考前人文獻(xiàn)[12-14]，具體計(jì)算方法如下：

發(fā)芽指數(shù)=Σ(Gt/Dt)

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×根長(zhǎng)

其中，Gt為第t天種子的發(fā)芽量，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽試驗(yàn)天數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用Excel 2020進(jìn)行整理，并運(yùn)用SPSS 19.0 和DPS 9.01分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。參試材料采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法計(jì)算材料的綜合隸屬函數(shù)值，并對(duì)所有材料的綜合耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)。為減少材料中單一指標(biāo)的差異性過(guò)大而影響結(jié)論，計(jì)算采用了多個(gè)指標(biāo)的相對(duì)值進(jìn)行分析，包括相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)活力指數(shù)。

模糊隸屬函數(shù)的計(jì)算公式：F=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中F表示某一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，X表示某一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定值，Xmin，Xmax為所有參試材料某一指標(biāo)的最小值和最大值；如果某一指標(biāo)與抗性指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，可通過(guò)反隸屬函數(shù)計(jì)算，計(jì)算公式為：F= 1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。隸屬函數(shù)平均值越大表明該品種的耐鹽性越強(qiáng)[15]。每份材料先通過(guò)模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)的公式計(jì)算出各指標(biāo)的隸屬值，然后再把同一品種的不同指標(biāo)的隸屬函數(shù)值累加求平均值，最后把平均值用DPS軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽堿濃度對(duì)綠穗莧種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，鹽堿脅迫對(duì)綠穗莧的種子萌發(fā)有抑制作用，且隨著NaHCO3濃度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，但不同指標(biāo)對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)不同：當(dāng)NaHCO3濃度達(dá)到40 mmol· L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，幼苗的根長(zhǎng)顯著縮短，但發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和芽長(zhǎng)并沒(méi)有顯著的變化；當(dāng)NaHCO3濃度達(dá)到80 mmol· L-1時(shí)，綠穗莧的發(fā)芽勢(shì)也開(kāi)始顯著降低(P<0.05)，但發(fā)芽率和芽長(zhǎng)兩個(gè)指標(biāo)只有在NaHCO3濃度達(dá)到120 mmol· L-1后才開(kāi)始顯著降低(P<0.05)。綜合考慮以上結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)采用100 mmol· L-1(pH 8.35)作為NaHCO3脅迫的處理濃度，用于篩選和評(píng)價(jià)不同綠穗莧種質(zhì)資源的耐鹽堿性。

表2 不同濃度NaHCO3溶液對(duì)綠穗莧各項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of different NaHCO3 solution on various indexes of A. hybridus

2.2 鹽堿脅迫對(duì)不同基因型綠穗莧種子萌發(fā)的影響

種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率是衡量植物耐鹽性的重要指標(biāo)之一[16]。由表3可知，在正常條件下，不同基因型綠穗莧種子間的發(fā)芽率除Ahb2外其它基因型間均無(wú)顯著差異，但發(fā)芽勢(shì)存在顯著差異，其中Ahb2和Ahb986顯著低于除Ahb1和Ahb1025外的其它基因型(P<0.05)。與對(duì)照組相比，除Ahb1外，鹽堿脅迫條件下綠穗莧種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均出現(xiàn)不同程度的下降，不同基因型的種子對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)存在顯著差異。其中，基因型Ahb1，Ahb911和Ahb979對(duì)鹽堿脅迫最不敏感，100 mmol·L-1NaHCO3處理?xiàng)l件下發(fā)芽率均高于90%，且與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；而基因型Ahb2，Ahb984，Ahb986，Ahb1011和Ahb1025的發(fā)芽率與對(duì)照相比顯著下降(P<0.05)，分別降低了34.88%，13.79%，53.85%，53.57%和52.83%。

表3 100 mmol·L-1 NaHCO3對(duì)8份不同基因型綠穗莧種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響Table 3 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on germination potential and germination rate of 8 A. hybridus seeds

鹽堿脅迫條件下，基因型Ahb1，Ahb911，Ahb979和Ahb984的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽率均高于80%，其余基因型均較低，其中Ahb1011的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)僅為23.64%(圖1)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，8份材料中，大部分材料的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽率數(shù)值相近，只有Ahb1011的差異較大，分別為23.64%和46.43%，說(shuō)明鹽堿脅迫在Ahb1011種子萌發(fā)早期的抑制作用較為明顯。

圖1 100 mmol·L-1 NaHCO3對(duì)8份綠穗莧種子相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(a)和相對(duì)發(fā)芽率(b)的影響Fig.1 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on relative germination potential (a) and relative germination rate (b) of 8 A. hybridus seeds注：不同小寫(xiě)字母表示不同基因型材料間差異顯著(P<0.05)。下同Note：Different lowercase letters indicate significant difference among A. hybridus resources at the 0.05 level. The same as below

2.3 鹽堿脅迫對(duì)不同基因型綠穗莧幼苗生長(zhǎng)的影響

由表4可知，正常培養(yǎng)條件下，本試驗(yàn)8份綠穗莧材料的根長(zhǎng)之間存在一定的差異，其中基因型Ahb2的根長(zhǎng)最短，僅12.64 mm，Ahb979的根長(zhǎng)最長(zhǎng)，為40.81 mm。不過(guò)正常培養(yǎng)條件下，除Ahb2外，其它基因型的芽長(zhǎng)之間均無(wú)顯著差異。

表4 100 mmol·L-1 NaHCO3對(duì)8份不同基因型綠穗莧根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on root length and bud length of 8 A. hybridus

在鹽堿脅迫處理下，除Ahb984外，其他試驗(yàn)材料的根和芽的生長(zhǎng)均受到了顯著抑制。其中，Ahb2和Ahb1025兩份材料的根系受到鹽堿脅迫的抑制作用最小，相對(duì)根長(zhǎng)分別為19.76%和15.97%；Ahb911和Ahb979的根系受到鹽堿脅迫的抑制作用最大，相對(duì)根長(zhǎng)分別為9.59%和8.14%(圖2a)。不同材料的芽長(zhǎng)對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)也存在很大差異，其中，Ahb1受到的抑制作用最為明顯，相對(duì)芽長(zhǎng)僅為32.87%，而其他基因型的相對(duì)芽長(zhǎng)則都在40%以上。總體來(lái)看，堿性鹽脅迫條件下，大部分綠穗莧材料的根系受抑制程度比芽受抑制的程度更強(qiáng)，不同材料的相對(duì)根長(zhǎng)大多在20%以下，而相對(duì)芽長(zhǎng)則在30%到50%之間(圖2b)。通過(guò)計(jì)算根芽比可知，大部分材料的根芽比受到了鹽堿脅迫的顯著抑制，只有Ahb2和Ahb1025兩份材料與對(duì)照組的差異不顯著。

圖2 100 mmol·L-1 NaHCO3對(duì)8份綠穗莧相對(duì)根長(zhǎng)(2a)和相對(duì)芽長(zhǎng)(2b)的影響Fig.2 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on relative root length (2a) and relative bud length (2b) of 8 A. hybridus

2.4 鹽堿脅迫對(duì)不同基因型綠穗莧發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

由表5可知，8份不同基因型綠穗莧的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在堿性鹽脅迫處理下均有所下降，且不同基因型的下降幅度差異很大：基因型Ahb986，Ahb1011和Ahb1025的發(fā)芽指數(shù)下降幅度較大，分別高達(dá)67.16%，77.21%和69.76%，Ahb1下降幅度最小，僅10.53%；活力指數(shù)除了基因型Ahb2只下降了89.81%以外，其他材料的活力指數(shù)均下降90%以上，說(shuō)明100 mmol·L-1NaHCO3鹽溶液對(duì)受試種子的活力影響較大。

表5 100 mmol·L-1 NaHCO3對(duì)8份不同基因型綠穗莧種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Table 5 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on germination index and vigor index of 8 A. hybridus seeds

進(jìn)一步分析顯示(圖3)，相對(duì)發(fā)芽指數(shù)較低的基因型，其種子的相對(duì)活力指數(shù)也較低，比如Ahb986，Ahb1011和Ahb1025，相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)活力指數(shù)在受試材料中均較低。

圖3 100 mmol·L-1 NaHCO3對(duì)8份綠穗莧種子相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(3a)和相對(duì)活力指數(shù)(3b)的影響Fig.3 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on relative germination index (3a) and relative vigor index (3b) of 8 A. hybridus seeds

2.5 不同基因型綠穗莧種子萌發(fā)期耐鹽堿性綜合評(píng)價(jià)

為了全面綜合反映8份綠穗莧材料的耐鹽堿能力，本研究采用相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)活力指數(shù)這6項(xiàng)指標(biāo)，根據(jù)模糊隸屬函數(shù)公式計(jì)算出每一指標(biāo)對(duì)應(yīng)的隸屬函數(shù)值，然后通過(guò)所有指標(biāo)的函數(shù)值求出每個(gè)基因型的隸屬函數(shù)值，并以此為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)參試的綠穗莧材料萌發(fā)期的綜合耐鹽能力進(jìn)行評(píng)價(jià)及排序。結(jié)果如表6所示，參試的8份綠穗莧材料的隸屬函數(shù)平均值在0.182～0.707之間，綜合耐鹽性排序由強(qiáng)至弱依次為：Ahb1 > Ahb911 > Ahb2 > Ahb984 > Ahb979 > Ahb1025 > Ahb986 > Ahb1011。通過(guò)系統(tǒng)聚類分析，將以上8份綠穗莧材料大致分為三類：耐鹽堿性較好的種質(zhì)有Ahb1,Ahb911,Ahb2,Ahb984和Ahb979五個(gè)基因型，耐鹽堿性中等的只有Ahb1025，對(duì)鹽堿脅迫耐性較差的有基因型Ahb986和Ahb1011(圖4)。

表6 綠穗莧萌發(fā)期耐鹽性隸屬函數(shù)及排序Table 6 Membership functions and sorting of A. hybridus during germination

圖4 8份綠穗莧種質(zhì)資源耐鹽性聚類Fig.4 Dendrogram of salt tolerance for the 8 A. hybridus germplasm resources

3 討論

鹽堿脅迫條件下植物種子萌發(fā)情況在一定程度上體現(xiàn)了植物的耐鹽性，因此發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率是衡量植物耐鹽性的重要指標(biāo)[6]。本研究首先采用不同濃度NaHCO3溶液對(duì)綠穗莧種子進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)NaHCO3濃度高于40 mmol· L-1時(shí)綠穗莧的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均受到一定程度的抑制，且隨著NaHCO3溶液濃度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，這與前人的研究相符[17-19]。同時(shí)，一些研究發(fā)現(xiàn)，植物不同的生長(zhǎng)指標(biāo)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)不同，比如100 mmol· L-1的鹽脅迫雖然會(huì)抑制石竹(Dianthuschinensis)種子的萌發(fā)，但對(duì)植株幼苗的莖粗卻有顯著的促進(jìn)作用[20]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，植株的根長(zhǎng)在NaHCO3溶液濃度達(dá)到40 mmol· L-1時(shí)就顯著縮短，而NaHCO3溶液濃度為80 mmol· L-1時(shí)，綠穗莧的發(fā)芽勢(shì)才受到顯著的抑制，但該濃度條件下植株的發(fā)芽率和芽長(zhǎng)均未受到明顯影響，直至NaHCO3溶液濃度達(dá)到120 mmol· L-1時(shí)，發(fā)芽率和芽長(zhǎng)才開(kāi)始受到顯著抑制。因此，本試驗(yàn)采用100 mmol· L-1NaHCO3溶液開(kāi)展后續(xù)不同來(lái)源綠穗莧種子耐鹽堿性評(píng)價(jià)。

很多研究均表明，不同植物以及同一種植物的不同品種對(duì)鹽脅迫的耐性不同[21]。馮鐘慧等對(duì)6個(gè)不同品種的莧屬植物種子進(jìn)行萌發(fā)期耐鹽性鑒定，結(jié)果表明不同材料的種子萌發(fā)期耐鹽性表現(xiàn)差異顯著[22]。植物作為一個(gè)復(fù)雜的生命體，其對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)涉及到多種生理生化反應(yīng)，包括離子穩(wěn)態(tài)、滲透調(diào)節(jié)劑的合成、活性氧的清除和內(nèi)源激素的代謝等[23-24]。同時(shí)，植物的很多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程都會(huì)受到鹽堿脅迫的影響，只使用單項(xiàng)指標(biāo)難以全面準(zhǔn)確地反映植物品種的耐鹽堿能力[25-26]。因此，本研究在總結(jié)前人分析方法的基礎(chǔ)上，采用系統(tǒng)聚類分析及模糊隸屬函數(shù)等分析方法，選取鹽堿脅迫條件下6項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)的變化來(lái)評(píng)價(jià)綠穗莧種質(zhì)資源的耐鹽堿性強(qiáng)弱，避免了只分析單一指標(biāo)的片面性，使分析結(jié)果更加可靠[27]。

根據(jù)種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)可以對(duì)不同品種的耐鹽性進(jìn)行分類，比如，宋家興等人根據(jù)相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)芽長(zhǎng)5個(gè)指標(biāo)將37份無(wú)芒雀麥(Bromusinermis)進(jìn)行聚類分析，劃分為耐鹽、敏鹽、中度耐鹽3種類型[28]。本研究中亦采用相似方法，根據(jù)鹽堿脅迫下不同基因型的8份綠穗莧材料的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)大部分品種(80%左右)比較耐鹽。本研究還發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫對(duì)植物根生長(zhǎng)的抑制作用比對(duì)芽更加顯著，這也與徐曼等[29]和郭慧娟等人[30]的研究結(jié)果相符合。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)8份綠穗莧種子萌發(fā)期主要的生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫處理對(duì)綠穗莧的生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的抑制作用，且參試的8份材料其各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)不同，通過(guò)隸屬函數(shù)法分析，對(duì)受試8份綠穗莧種質(zhì)資源萌發(fā)期耐鹽性強(qiáng)弱進(jìn)行排序，結(jié)果為：Ahb1>Ahb911>Ahb2>Ahb984>Ahb979>Ahb1025>Ahb986>Ahb1011。通過(guò)聚類分析可以將受試種質(zhì)資源分為三大類，其中對(duì)鹽堿脅迫耐性較好的有Ahb1，Ahb2，Ahb984，Ahb911和Ahb979五個(gè)基因型，耐鹽堿性中等的只有Ahb1025，Ahb986和Ahb1011耐鹽堿性較差。