土壤中草甘膦檢測方法研究進展

朱 娜，元相虎，張宇競，張 浩

（吉林省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，吉林 長春130011）

草甘膦（Glyphosate，Gly）化學名稱N-磷酰基甲基甘氨酸，是由美國孟山都公司開發(fā)的除草劑，又稱鎮(zhèn)草寧、農(nóng)達（Roundup）、草干膦、膦甘酸。草甘膦是一種內(nèi)吸傳導型非選擇性廣譜除草劑，主要通過抑制植物體內(nèi)的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉(zhuǎn)化，干擾蛋白質(zhì)的合成，以致植物死亡。草甘膦的除草性能優(yōu)異并且價格低廉，因此廣泛應用于農(nóng)田各種雜草的防除，也常用于非農(nóng)田雜草的治理[1]。隨著抗草甘膦作物的培育成功，草甘膦的用量逐年遞增，目前成為世界上用量最大、應用最廣的除草劑之一，由于草甘膦大規(guī)模和大量的使用，其在土壤環(huán)境中的影響也受到世界各國的關(guān)注[2-3]。

1 草甘膦的環(huán)境危害

草甘膦在土壤中極易被吸附，代謝速度相對緩慢，在高劑量多年連續(xù)施用的情況下，其殘余水平可能會逐年升高[4]。草甘膦鹽類對植物的毒性程度不同，異丙胺鹽和三甲基硫鹽的毒性最高，胺鹽次之，鈉鹽較小。草甘膦曾長期被認為是一種低毒、安全的除草劑，然而草甘膦在全球的大規(guī)模使用，使其在水體和土壤中累積量增加，已經(jīng)對地表水、地下水和土壤的化學過程以及整個生態(tài)系統(tǒng)造成影響，并且給人類生存環(huán)境帶來安全風險，威脅人類健康[5]。研究發(fā)現(xiàn)，土壤中殘留的草甘膦會影響微生物的數(shù)量和土壤酶的活性，對放線菌數(shù)量和脲酶的活性有抑制作用，進而破壞土壤微生態(tài)[6-7]。土壤中殘留的草甘膦會隨地表徑流進入地表水、地下水，水環(huán)境質(zhì)量遭到破壞，造成水生生態(tài)的失衡[8]。

通常來說草甘膦對非靶標生物毒性較低，然而，隨著草甘膦毒理學及生態(tài)效應研究的深入，草甘膦具有生殖毒性、誘突變性等環(huán)境激素效應的文獻時有報道，草甘膦對人體健康和生態(tài)環(huán)境都存在極大的潛在危害[9-11]。近年來研究[12-13]表明草甘膦對水生生物、兩棲類動物、藻類生物、土壤生物以及人和哺乳動物具有一定的毒性，對人和哺乳動物的毒性主要表現(xiàn)為細胞毒性、遺傳毒性、生殖發(fā)育毒性、致癌性以及內(nèi)分泌干擾作用等，但是關(guān)于草甘膦的毒性問題國際上仍然存在爭議，特別是草甘膦致癌性的問題，甚至不同研究機構(gòu)給出完全相反的結(jié)論[14-17]。

2 草甘膦質(zhì)量標準

針對其對生物和生態(tài)環(huán)境潛在危害性，我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB 5749-2006）[18]規(guī)定草甘膦在飲用水中的最大殘留量限值為0.7mg/L，與美國環(huán)保署對地表水中的限量相同。目前，美國、歐盟和日本都制定了土壤中草甘膦殘留標準，殘留限值為0.1～0.5mg/kg，而我國現(xiàn)在尚無土壤中草甘膦殘留量的明確規(guī)定。在《土壤環(huán)境質(zhì)量標準》（修訂）（GB 15618-2008）征求意見稿中，將草甘膦限值0.5mg/kg列入到有機污染物環(huán)境質(zhì)量的第二級標準值，但修訂的土壤環(huán)境質(zhì)量標準一直沒有公開發(fā)布。我國《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2014）[19]規(guī)定食品中草甘膦最大殘留限量為0.05～5mg/kg，由于食品中草甘膦的殘留與土壤中的殘留密切相關(guān)，我們要關(guān)注土壤中草甘膦殘留，進而保證農(nóng)產(chǎn)品安全。雖然現(xiàn)已公開發(fā)布的《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618-2018）[20]中無草甘膦這項控制指標，見表1。

表1 草甘膦相關(guān)質(zhì)量標準

3 國內(nèi)外相關(guān)分析方法

目前，草甘膦的測定方法主要有柱前或柱后衍生-液相色譜法、離子色譜法、柱前衍生-氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細管電泳法、分光光度法等。

美國EPA只有推薦方法MRID 443265-06和MRID 443265-07測定土壤中草甘膦，而無發(fā)布的土壤中草甘膦及沉積物中的標準檢測方法。在國標GB/T 5750.9-2006[21]和GB 5085.6-2007[22]分別規(guī)定了生活飲用水和危險廢物中草甘膦的檢測方法。2019年10月29日，生態(tài)環(huán)境部公開發(fā)布《土壤和沉積物 草甘膦的測定 高效液相色譜法》（HJ 1055-2019）[23]為國家環(huán)境保護標準的公告，該標準使用液相色譜-柱前衍生的方法，測定土壤和沉積物中的草甘膦?，F(xiàn)將國內(nèi)外相關(guān)測定草甘膦的標準分析方法總結(jié)見表2。表2中所列的方法涉及的介質(zhì)有水、土壤和食品，基本上都采用液相/氣相色譜法或者液質(zhì)/氣質(zhì)聯(lián)用，樣品經(jīng)過提取、凈化，然后進行衍生化處理，色譜柱分離后采用FLD、ECD或FPD檢測分析，靈敏度高；而DB37/T 4152-2020采用離子色譜法，不需要衍生化，色譜分離后電導檢測器檢測，與液相、氣相色譜法比較，離子色譜操作簡單，無污染，但靈敏度相對較低。

表2 國內(nèi)外草甘膦標準分析方法

3.1 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法由于其分析速度快、靈敏度高、定量精確和高自動化等特點，是目前廣泛應用的分離分析技術(shù)。由于草甘膦為強極性兩性化合物，沒有發(fā)色和熒光基團，在使用液相色譜-紫外（熒光）檢測器測定草甘膦殘留之前，必須對樣品進行衍生化的處理，步驟繁瑣。王超等[24]通過考察柱前衍生、流動相等相關(guān)因素的實驗條件，結(jié)合影響草甘膦檢測精確度的單因素實驗，建立了采用柱前衍生-高效液相色譜法，檢測桑園土壤中草甘膦殘留量的方法。并對該方法的準確性和精密度進行了驗證，結(jié)果表明：草甘膦濃度在5.0～35.0μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9992，在0.1～1.0μg/g添加量范圍內(nèi)，桑園土壤中草甘膦的平均回收率為98.5%～103.0%，變異系數(shù)為3.54%～4.08%。高俊海等[25]建立了測定土壤中草甘膦和氨甲基膦酸的液相色譜熒光法，土壤經(jīng)0.1mol/LNaOH溶液提取、中性樣液HLB固相萃取凈化、FMOC-Cl堿性條件常溫2h衍生化處理、二氯甲烷凈化的方法制備待測溶液，采用高效液相色譜熒光檢測器測定，結(jié)果表明，在2.0～100μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＞0.999）。針對土壤樣品加標，草甘膦回收率為82.2%～86.8%，RSD%為0.3%～2.5%，AMPA回收率為61.8%～69.1%，RSD%為0.8%～1.2%。

3.2 高效液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜法是國內(nèi)外比較認可的檢測方法，由于其良好的重現(xiàn)性和準確性，廣泛應用于有機物的分析，許多研究也采用此方法分析水、土壤等環(huán)境介質(zhì)中草甘磷。周芹等[26]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，以磷酸鈉和檸檬酸三鈉混合溶液提取，凈化后采用正向親水性液相色譜柱梯度洗脫，通過多反應監(jiān)測（MRM）負離子模式掃描進行測定，結(jié)果表明：草甘膦、氨甲基膦酸的線性范圍為0.02～0.2μg/mL，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9995、0.9998，檢出限分別為0.5μg/kg和0.6μg/kg，并進行3個水平的加標實驗，草甘膦的回收率在79.67%～96.17%之間，RSD值為3.95%～7.49%；氨甲基膦酸回收率在77.83%～99.47%之間，RSD值為1.96%～3.89%。此方法前處理簡單，不需要柱前衍生，具有檢出限低、靈敏度高的優(yōu)點。

文喚成等[27]通過對提取條件、色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了以水為提取劑，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定土壤中草甘膦殘留量的方法，該方法的檢出限為0.10mg/kg，加標回收率在85.8%～94.6%之間，方法操作簡單、快速，加標回收率滿足分析要求，方法重復性、穩(wěn)定性較好。

3.3 離子色譜法

離子色譜法是利用待測物在離子交換樹脂柱與流動相間的反復交換，使樣品中各離子分離，根據(jù)電導的變化采用電導檢測器檢測的方法。草甘膦易溶于水，采用離子色譜法電導檢測不需要衍生化，簡化了前處理過程，具有選擇性好，靈敏、快速的優(yōu)點。Ioannis K等[28]采用Dionex AS18色譜柱，KOH梯度洗脫測定泉水和橙子中草甘膦和氨甲基膦酸的含量，方法檢出限分別為0.54μg/L、0.01mg/kg。劉玉欣等[29]采用IonPac AS11-HC陰離子交換柱，通過條件的優(yōu)化，在淋洗液20mmol/L KOH溶液，流速1.00mL/min，進樣量100μL的色譜條件下，直接測定飲用水中草甘膦殘留量，采集的水樣需經(jīng)抗壞血酸除去余氯，樣品進入離子色譜分析前采用微孔濾膜過濾。張培志等[30]在碳酸鈉和碳酸氫鈉的混合淋洗液下，采用電導檢測，對土壤樣品中的常見無機陰離子和草甘膦進行分離測定，取得理想的分離效果和較高的靈敏度。楊健等[31]利用離子色譜結(jié)合磁固相萃取技術(shù)，建立了一種簡單快速測定土壤樣品中草甘膦殘留的方法，并對提取溶劑、離子色譜條件以及凈化吸附劑進行了優(yōu)化。樣品經(jīng)水提取后，先用乙腈沉淀雜質(zhì)，再用Fe3O4磁性納米材料凈化處理，經(jīng)IonPac AS11－HC離子色譜柱分離，以30mmol/L KOH為淋洗液，使用電導檢測器進行檢測。

3.4 氣相色譜法

由于草甘膦極性大、沸點高、缺少發(fā)色基團和熒光基團，采用氣相色譜分析時，需要對樣品進行衍生化，生成可以檢測到的衍生物，前處理步驟繁瑣。胡繼業(yè)等[32]采用氣相色譜法測定土壤和蘋果中草甘膦的殘留，土壤中草甘膦的最小檢出量為9×10-12g，最低檢出濃度為0.02mg/kg。王天玉等[33]采用固相萃取-氣相色譜法測定三種中藥材中草甘膦的殘留，樣品提取后經(jīng)C18柱凈化，在100℃條件下，與三氟乙醇（TFE）和三氟乙酸酐（TFAA）進行衍生化反應，使用氮磷檢測器（NPD）檢測，外標法定量。結(jié)果表明，草甘膦在0.05～10mg/L之間線性良好，相關(guān)系數(shù)0.9992，方法的檢出限均為0.05mg/kg。草甘膦在薏苡仁、白茯苓和山藥3種中藥材中的加標回收率分別為97.6%～103.8%，88.8%～98.4%和92.1%～100.0%；相對標準偏差（RSD）分別為：4.2%～5.6%，3.0%～4.7%和3.4%～6.5%，以上方法學指標均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

3.5 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有高分離能力、高靈敏度的特點，在分離和檢測方面具有優(yōu)越性。美國EPA推薦方法MRID 443265-06采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析土壤中的草甘膦，該方法采用氨水和磷酸鉀混合液（pH13左右）振蕩提取，0.45μm膜過濾后，用七氟-1-丁醇和三氟乙酸酐衍生化，檢測限0.05mg/kg。農(nóng)業(yè)標準NY/T 1096-2006[34]規(guī)定了食品中草甘膦及其代謝物殘留量的測定方法。試樣以水提取，粗提液經(jīng)二氯甲烷液液分配和離子交換柱（CAX）凈化，用與三氟乙酸酐和七氟丁醇的混合液衍生化反應后，衍生物用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀定性，采用離子選擇模式外標法定量。該標準的檢出限為0.02mg/kg。該標準適用于蔬菜、水果和糧食類等產(chǎn)品中草甘膦及其代謝物殘留量的測定。

3.6 分光光度法

在國標GB/T12686-2017[35]和GB/T 20684-2017[36]中，均介紹了采用紫外分光光度法測定草甘膦原藥和水劑，該方法對實驗室儀器設(shè)備要求不高，檢測靈敏度不高，還存在受Fe2+、Fe3+和其他相近光吸收物質(zhì)的干擾，限制了光度法在分析草甘膦上的廣泛應用。董文庚等[37]利用草甘膦與微量過量的溴反應，剩余的溴能使羅丹明B褪色的原理測定廢水中草甘膦的含量。在醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，草甘膦在0～0.5mg/L和0.4～0.9mg/L范圍內(nèi)，與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，干擾實驗表明，F(xiàn)e3+、Fe2+和三乙胺對測定存在干擾，經(jīng)過交換樹脂和吸附樹脂的凈化，可消除干擾，方法用于測定草甘膦生產(chǎn)廢水中的草甘膦時，回收率為94%～101%。

4 結(jié)束語

目前，色譜法是草甘膦檢測應用最廣泛的檢測方法，由于草甘膦為強極性兩性化合物、易溶于水、難溶于大多數(shù)有機溶劑、揮發(fā)性差、沒有發(fā)色和熒光基團，在使用氣相色譜法和高效液相色譜法測定前，必須進行衍生化處理，衍生化包括柱前和柱后衍生兩種，衍生過程比較復雜，衍生副產(chǎn)物可能干擾測定，不適合大量樣品檢測，準確度的干擾因素也較多。相比于氣相色譜分析，液相色譜法其前處理程序相對簡化、衍生化操作可控性較好，并且草甘膦易溶于水，高效液相色譜法在前期處理和后期分離更具有優(yōu)勢。氣質(zhì)聯(lián)機和液質(zhì)聯(lián)機檢測的精密度和準確度較好，但對儀器和人員要求較高，檢測成本高，不利于推廣使用。光度法存在靈敏度不高、其他物質(zhì)干擾的缺陷，而離子色譜法不需要衍生化，可以大體積進樣分析，操作簡便，對人體健康和環(huán)境沒有危害，但靈敏度稍低于液相色譜法和氣相色譜法。

本文對草甘膦殘留的檢測方法和研究進展進行綜述，為檢測方法的深入研究提供參考。草甘膦檢測方法的研究，將有助于了解草甘膦在土壤中的殘留狀況，為草甘膦施用策略管理及環(huán)境生態(tài)監(jiān)控提供有效的測試手段，從而進一步推進土壤中草甘膦殘留標準限值的制定。