真武湯治療腎纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制研究＊

張怡萍，王 倩，肖 雪，嚴(yán)詩楷，鄧遠(yuǎn)輝＊＊，李莎莎＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510006；2. 廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院 廣州 510006；3. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院 上海 200240）

腎臟纖維化是腎臟在一系列致病因子的刺激下由腎臟固有細(xì)胞受損發(fā)展成為功能逐步喪失的漸進(jìn)過程，腎間質(zhì)纖維化、腎小球萎縮及腎小管硬化為腎纖維化主要的病理特征[1]。由于腎纖維化為各種慢性腎臟疾?。–hronic Kidney Disease, CKD）最終進(jìn)展為腎功能障礙甚至尿毒癥的共同病理演變途徑，因此在慢性腎臟病的發(fā)病過程中，腎纖維化是不容忽視的一個(gè)重要病理過程。目前研究表明腎纖維化發(fā)病過程復(fù)雜且與諸多因素有關(guān)，涉及到炎癥因子調(diào)控（促纖維化因子、抑纖維化因子）、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成及積累、氧化應(yīng)激等多個(gè)環(huán)節(jié)[2-4]，臨床上腎纖維化疾病尚無法治愈，因此有必要對腎纖維化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探究以期為該病的臨床診斷及治療提供新的思路。

真武湯出自于《傷寒論》中的經(jīng)典名方，由生姜、炮附子、茯苓、白芍、白術(shù)五味藥組成，具有溫陽利水的功效[5]。臨床上真武湯加減常用于治療腎臟相關(guān)的各種疾病中，如糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎、腎病綜合征、急性腎衰竭等，患者經(jīng)真武湯治療后其臨床癥狀、免疫功能得到明顯的改善，且藥物的安全性高[6]。課題組前期藥理實(shí)驗(yàn)表明真武湯有明顯改善腎纖維化、延緩病情發(fā)展的功能[7-9]，但由于藥味組成復(fù)雜，化學(xué)成分較多，對于真武湯治療腎纖維化的活性成分及潛在作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入探索。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，主要以文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，同時(shí)結(jié)合多種組學(xué)、高通量數(shù)據(jù)分析、網(wǎng)絡(luò)分析及虛擬計(jì)算等技術(shù)，通過構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，闡明疾病的發(fā)生發(fā)展過程、藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有系統(tǒng)性及整體性的特點(diǎn)，與中藥及其組方制劑的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的作用特點(diǎn)相似，在防治復(fù)雜疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[10]。因此本文主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析真武湯的藥效活性成分及潛在作用靶點(diǎn)，深入闡明真武湯治療腎纖維化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 真武湯活性成分的篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http//lsp.nwu.edu.cn./tcmsp.php）對真武湯各單味藥附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata）、茯苓（Poria Cocos Wolf）、生 姜（Zingiber Officinale Roscoe）、白 術(shù)（Atractylodes Macrocephala Koidz）、白 芍（Paeoniae Radix Alba）進(jìn)行檢索，獲得真武湯的主要化學(xué)成分，以成分的口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）作為篩選條件對各味藥的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，選取OB ＞30%和DL ＞0.18 的成分為真武湯治療腎纖維化的主要活性成分。

1.2 藥效成分靶點(diǎn)預(yù)測

采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得篩選后藥效成分的靶蛋白，將篩選得到的靶蛋白英文名輸入到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（uniprot）中，收集對應(yīng)的靶點(diǎn)基因；同時(shí)利用pubmed數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）獲得真武湯活性成分相應(yīng)的典型SMILES 結(jié)構(gòu)，將獲得的SMILES 結(jié)構(gòu)導(dǎo) 入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫中，利用平臺反向藥效團(tuán)匹配方法得到虛擬篩選結(jié)果，收集相關(guān)靶點(diǎn)基因，將上述兩種方式合并去除重復(fù)靶點(diǎn)建立藥效活性成分靶標(biāo)庫。

1.3 腎纖維化靶點(diǎn)的篩選

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以腎纖維化（renal fibrosis）為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，得到與腎纖維化相關(guān)的基因，作為疾病的候選靶點(diǎn)基因。

1.4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述真武湯藥效成分、成分作用的靶點(diǎn)及疾病作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.5.0 軟件進(jìn)行可視化分析，結(jié)果共得到四個(gè)網(wǎng)絡(luò)：“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、“活性成分-疾病共有靶點(diǎn)PPI”網(wǎng)絡(luò)、“成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)、“核心成分-疾病-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，活性成分、作用靶點(diǎn)及潛在作用通路用不同顏色的節(jié)點(diǎn)（node）表示。若某一靶點(diǎn)為某化合物的潛在作用靶點(diǎn)，則以邊（edge）相連，通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)研究真武湯治療腎纖維化多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用。

1.5 靶點(diǎn)通路注釋分析

取活性成分靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)的交集基因，利用軟件中的clugo 插件對獲取的靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因本體論信息資源數(shù)據(jù)庫（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，通過設(shè)定閾值P＜0.01 選取具有顯著性差異的所有通路，篩選靠前的幾條通路通過KEGG（https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行整合并繪制最終的通路圖。

2 結(jié)果

2.1 真武湯藥效成分篩選

本研究利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫根據(jù)口服生物利用度和類藥性作為篩選標(biāo)準(zhǔn)共得到真武湯候選藥效成分61 種，其中附子21 種，茯苓15 種，白芍13 種，白術(shù)7種，生姜5 種，經(jīng)剔除未篩查到靶點(diǎn)的成分，最終獲得藥效成分43 種，其中β-谷甾醇是附子和白芍的共有成分，表1為成分篩選后的結(jié)果。

2.2 真武湯化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩查藥效成分及藥效成分的靶蛋白，將篩選得到的靶蛋白英文名輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫中，得到成分靶點(diǎn)基因；另外將TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩查到的藥效成分采用Pubchem 數(shù)據(jù)庫搜索SMILES號，在Swiss Target Prediction 中輸入SMILES 號，物種選擇“Homo sapiens”，找到相應(yīng)的靶點(diǎn)基因。將這兩種方法篩選到的成分取并集，刪除兩者共同的成分靶點(diǎn)，篩選出257個(gè)藥效成分的靶點(diǎn)，得到成分靶點(diǎn)關(guān)系767對。

2.3 活性成分-腎纖維化共有靶點(diǎn)的篩選

以“renal fibrosis”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，結(jié)果得到與腎纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)基因3995個(gè)，選取Score 值前1000 個(gè)基因?qū)雋ttps://string-db.org/網(wǎng)站中，得到腎纖維化靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，將腎纖維化靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscap 3.5.0 中，在Cytoscap 3.5.0 中將活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和腎纖維

化靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)利用merge 功能進(jìn)行合并，得到66個(gè)活性成分與疾病的共有靶點(diǎn)。

表1 真武湯藥效成分篩選結(jié)果

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

2.4.1 真武湯活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.5.0 軟件構(gòu)建真武湯“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)如圖1-A 所示。該網(wǎng)絡(luò)共包含300 個(gè)節(jié)點(diǎn)，766 條邊，其中藥效成分有43 個(gè)節(jié)點(diǎn)，與藥效成分相關(guān)的靶點(diǎn)基因有257個(gè)節(jié)點(diǎn)。

2.4.2 活性成分-疾病共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.5.0軟件對66個(gè)與腎纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建可視化分析。如圖1-B 所示，活性成分-疾病共有靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖總共包括65個(gè)節(jié)點(diǎn)，546 條邊（其中1 個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)無相互作用關(guān)系）。

2.4.3 成分-疾病-靶點(diǎn)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)

將獲得到的66 個(gè)與腎纖維化相關(guān)聯(lián)的潛在作用靶點(diǎn)，利用Cytoscap 3.5.0 中的Cluego 插件對靶點(diǎn)基因生物學(xué)過程及代謝通路進(jìn)行富集分析。設(shè)置P＜0.01表示具有非常顯著性差異的代謝通路，結(jié)果得到真武湯活性成分43 個(gè)，共同的靶點(diǎn)66 個(gè)，參與的關(guān)鍵通路19 條，如圖1-C 所示。在網(wǎng)絡(luò)圖中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小和其Degree（度）值大小相關(guān)，節(jié)點(diǎn)越大顏色越深代表該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用。在“成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中有23個(gè)靶點(diǎn)未富集到相關(guān)的腎纖維化代謝通路，在圖中采用白色圓圈顯示，處于網(wǎng)絡(luò)中心的靶點(diǎn)蛋白TNF、AKT1、MAPK8 為參與通路數(shù)量大于10 的三個(gè)靶蛋白，其他疾病靶點(diǎn)根據(jù)靶點(diǎn)的Degree 值是否大于所有靶點(diǎn)的平均值則用不同大小呈現(xiàn)。

2.4.4 核心成分-疾病-核心靶點(diǎn)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)

以能夠聚集到通路的43 個(gè)靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，剔除無核心靶點(diǎn)的成分，結(jié)果33 個(gè)核心成分能夠作用于43 個(gè)核心靶點(diǎn)，參與的關(guān)鍵通路19 條，如圖1-D 所示。以Degree 值大于所有靶點(diǎn)平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵核 心 靶點(diǎn)，TNF、AKT1、MAPK8、IL6、CASP3、JUN、

BCL2、TGFB1、PRKCB、BAX、CASP8、INSR、PTGS2、ICAM1、SELE、VCAM1、NOS3、STAT1 等18 個(gè)靶點(diǎn)位于網(wǎng)絡(luò)中心，為真武湯治療腎纖維化的重要靶點(diǎn)。33 個(gè)核心成分作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)及關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，如表2 所示。

2.5 真武湯治療腎纖維化活性成分潛在靶點(diǎn)的通路注釋

在GO 功能富集分析過程中，共確定了101 個(gè)GO條目，其中有10 條關(guān)于分子功能，主要涉及類固醇激素受體活性、胰島素受體結(jié)合、過氧化物酶的活性、氧化還原酶的活性、ATP 酶的活性等方面；91 條關(guān)于生物學(xué)過程，主要涉及活性氧（ROS）代謝過程的調(diào)控、白細(xì)胞介素-6（IL-6）產(chǎn)生的調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）產(chǎn)生的調(diào)控、一氧化氮（NO）生物合成的調(diào)控等方面。

在KEGG 通路富集分析中，共得到19 條相關(guān)通路。將通路按照P 值從小到大進(jìn)行排序，得到真武湯治療腎纖維化的潛在通路，如表3 所示，其中AGERAGE 信 號 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、胰島素抵抗信號通路（Insulin resistance）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、Toxoplasmosis信號通路、乙型肝炎信號通路（Hepatitis B）、非酒精性脂肪肝信號通路（Non-alcoholic fatty liver disease）為真武湯治療腎纖維化的重要信號通路。

2.6 真武湯治療腎纖維化通路分析

將治療腎纖維化的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)與前三條通路通過KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路注釋分析，并進(jìn)行整合繪制最終的通路圖（如圖2）。通路中的靶點(diǎn)為藍(lán)色長方形標(biāo)記，真武湯治療腎纖維化的靶點(diǎn)為紫色橢圓標(biāo)記，由圖中可以看出AGE-RAGE信號通路為主要的信號通路，該通路與多個(gè)通路相關(guān)，并且多個(gè)靶點(diǎn)直接/間接地通過該通路發(fā)揮治療腎纖維化的作用，同時(shí)

Insulin resistance signaling pathway、TNF signaling pathway、 PI3K-AKT signaling pathway、 TGF- β signaling pathway 及其他信號通路共同參與腎纖維化的過程，為真武湯治療腎纖維化的重要信號通路。

3 討論

3.1 真武湯核心成分-關(guān)鍵核心靶點(diǎn)探討

圖1 網(wǎng)絡(luò)互作圖

由表2可知山奈酚、β-谷甾醇、得爾妥因、豆甾醇、兒茶素、芍藥吉酮、茯苓酸、水黃皮素、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、麥角甾醇過氧化物、6-甲基姜二醇雙乙酸、芍藥苷等活性成分均可作用于關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，其中山奈酚、β-谷甾醇對應(yīng)的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)最多，分別為13 個(gè)和6個(gè)。山奈酚為白芍中的黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[11]，有研究表明在糖尿病腎病大鼠中，山奈酚能夠降低大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，同時(shí)降低caspase-3、caspase-9、NLRP3、ASC 和caspase-1 及炎癥因子IL-18 和IL-1β的表達(dá)水平，對腎功能和組織病理損傷具有保護(hù)作用[12]。β-谷甾醇為來源于白芍和附子中的三萜類成分，具有降脂、抗氧化、免疫調(diào)解等作用，Loizou 等[13]研究表明β-谷甾醇能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）和細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1）表達(dá)，減弱NF-kB p65 磷酸化，提示β-谷甾醇有抗內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的作用，同時(shí)β-谷甾醇葡萄糖苷也有強(qiáng)的抑制TNFα、IL-1β和IL-6炎癥因子作用。芍藥苷對應(yīng)的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)為TNF、IL6，TNF、IL6 為腎纖維化發(fā)生關(guān)鍵炎性細(xì)胞因子，在促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚及在加速腎小球硬化進(jìn)展中起重要作用[14]，表明芍藥苷能直接參與治療腎纖維化的過程。來自茯苓中的茯苓酸和麥角甾醇過氧化物主要作用于NOS3 等疾病靶點(diǎn)，NOS3 為內(nèi)皮性一氧化氮合酶基因，主要功能是參與精氨酸和脯氨酸代謝，并催化生成一氧化氮（NO），NO具有調(diào)節(jié)血管張力和影響內(nèi)皮功能，腎組織各個(gè)部位的固有細(xì)胞均能分泌NO，腎固有細(xì)胞NO 分泌不足可引起細(xì)胞損傷及內(nèi)皮功能障礙，因此NO 的釋放在維持腎臟正常生理功能中具有重要意義[15]。其他成分可作用的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)較少，但都能作用于同一個(gè)疾病靶點(diǎn)PTGS2，PTGS2 為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2，在外部環(huán)境的刺激下，腎固有細(xì)胞中PTGS2 的表達(dá)上調(diào)，催化花生四烯酸類物質(zhì)，通過環(huán)氧酶的作用產(chǎn)生多種前列腺素，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗纖維化的作用[16]，表明真武湯的多數(shù)成分可以通過PTGS2 靶點(diǎn)調(diào)控腎纖維化過程。

表2 核心成分-核心靶點(diǎn)

由成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)探討得知：白芍中的山奈酚、兒茶素、芍藥苷及茯苓中的茯苓酸和麥角甾醇過氧化物

等成分為真武湯中治療腎纖維化的主要活性成分，其中，白芍中的山奈酚、兒茶素、茯苓酸所對應(yīng)的靶點(diǎn)TNF、AKT1、MAPK8、IL6、CASP3、JUN、TGFβ1 等均被證實(shí)與腎纖維化發(fā)展密切相關(guān)[17-21]，現(xiàn)代藥理研究表明白芍具有免疫抑制樣作用，而腎臟疾病多以免疫因素為驅(qū)動因素，因此白芍應(yīng)用于治療腎臟疾病具有充分的理論依據(jù)，另外其他成分可通過NOS3、PTGS2 或其他靶點(diǎn)共同治療腎纖維化。

表3 真武湯治療腎纖維化潛在靶點(diǎn)的通路

圖2 KEGG通路富集分析圖

3.2 靶點(diǎn)GO功能分析

GO 分析結(jié)果表明，核心靶點(diǎn)主要涉及類固醇激素受體活性、胰島素受體活性、過氧化物酶的活性、氧化還原酶的活性、ATP 酶的活性等分子功能，涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控、活性氧代謝過程的調(diào)控、白細(xì)胞介素-6 產(chǎn)生的調(diào)控、血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)生的調(diào)控、一氧化氮生物合成的調(diào)控等生物過程，提示真武湯治療腎纖維化與胰島素受體活性、能量代謝、氧化應(yīng)激及調(diào)節(jié)腎纖維化相關(guān)因子表達(dá)的水平有關(guān)。西醫(yī)認(rèn)為糖尿病為導(dǎo)致腎臟疾病的重要因素，因此糖尿病腎病患者通過注射胰島素可使腎小球肥大得到緩解，同時(shí)能減少患者尿微量白蛋白的含量，降低腎小球?yàn)V過率，改善疾病進(jìn)程[1]。氧化應(yīng)激會導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生，在腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展中ROS 的濃度對調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化起著至關(guān)重要的作用，前期實(shí)驗(yàn)[22]表明真武湯能使腎纖維化大鼠血清中谷胱甘肽（GSH）及腎臟中ROS 的水平恢復(fù)正常，超氧化物歧化酶（T-SOD）活性增加且維持在較高水平，同時(shí)可以提高乳酸脫氫酶（LDH）、ATP 及線粒體功能相關(guān)的酶的活性，尤其是對有氧呼吸具有整體調(diào)節(jié)作用，表明真武湯可通過緩解體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、增加能量代謝治療腎纖維化，進(jìn)一步證實(shí)了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 KEGG通路分析

AGE-RAGE 信號通路的激活與腎纖維化發(fā)病密切相關(guān)，該通路中與腎纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)量最多有16 個(gè)并且與多條通路協(xié)同調(diào)控腎纖維化進(jìn)程，廣泛參與細(xì)胞凋亡、血管生成及炎癥反應(yīng)等。AGEs 為晚期糖基化終末產(chǎn)物，RAGE 為晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，AGE 與RAGE 蛋白相互結(jié)合可以激活PI3K/Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶）信號通路，PI3K/Akt 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能方面起著重要作用[23]，PI3K可與其下游分子Akt結(jié)合釋放大量的炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)加速腎纖維化進(jìn)程。鐘利平等[24]在研究抗纖靈方對PI3K/AKT/mTOR 信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)抗纖靈方能夠改善模型小鼠24 h 尿蛋白、尿素氮、血肌酐含量，其機(jī)制與抑制PI3K/AKT/m TOR 信號通路表達(dá)相關(guān)。同時(shí)AGE與RAGE蛋白結(jié)合后可作用于細(xì)胞內(nèi)的還原型輔酶Ⅱ（NADPH），在生物體的酶促反應(yīng)中NADPH 可作為還原劑參與多種合成代謝反應(yīng)，并起到傳遞氫體的作用，NADPH在NADPH氧化酶的作用下產(chǎn)生ROS，肝臟中的血管緊張素原（AGT）被ROS 裂解形成血管緊張素I（AngI），AngI 繼而被ACE 加工處理生成AngⅡ，AngⅡ在細(xì)胞質(zhì)膜上都含有的G 蛋白偶聯(lián)受體—AT1R 介導(dǎo)下激活TGF-β信號通路，其中TGF-β1是腎纖維化的關(guān)鍵炎性因子，其促纖維化作用主要通過下游Smads 家族傳遞信號，TGF-β1 上調(diào)可通過TGF-β1/Smad 信號通路使ECM 過度積聚，從而導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生。

腫瘤壞死因子（TNF-α）主要由單核巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有重要生物活性的炎癥細(xì)胞因子，也可由腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，TNF-α與1 型 受 體（TNFR1 又 稱 作p60，p55，CD120a）在胞外區(qū)結(jié)合，使TNFR1 形成一個(gè)三聚體，三聚體的TNFR1 在細(xì)胞內(nèi)聚集招募下游傳導(dǎo)蛋白（TRADD、TRAF2/5、RIPI），下游傳導(dǎo)蛋白形成LKK 激酶復(fù)合體，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB，活化的NF-kB 和抑制因子IkB-β結(jié)合能夠誘導(dǎo)或激活TNF-α和IL-6 的產(chǎn)生，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，激活NF-kB 通路誘導(dǎo)下游的CASP8 以及其他效應(yīng)分子CASP3/CASP8，產(chǎn)生級聯(lián)激活反應(yīng)，最終引起靶細(xì)胞凋亡。同時(shí)TNF 與2 型受體（TNFR2，又稱作p80，p75，CD120b）結(jié)合，通過TRAF 家族成員相關(guān)的NF-kB 激活劑介導(dǎo)PI3K-Akt信號通路促進(jìn)腎臟纖維化發(fā)生。

腎臟是胰島素的靶器官，含有豐富的胰島素受體，包括腎小球足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和集合管上皮細(xì)胞在內(nèi)的腎固有細(xì)胞，均對作為效應(yīng)細(xì)胞的胰島素高度敏感，這些細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能異常與胰島素及其受體活性密切相關(guān)[25]，胰島素抵抗是慢性腎臟病進(jìn)展的機(jī)制之一，文獻(xiàn)報(bào)道足細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過的功能上發(fā)揮重要作用，而胰島素可調(diào)節(jié)VEGF 在腎臟中的表達(dá)，表明Insulin resistance 信號通路在為真武湯治療腎纖維化的重要通 路[26]。 其 他 信 號 通 路 如Fluid shear stress and atherosclerosis、Toxoplasmosis、Non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）等參與腎纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)較多，提示其在腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程可能發(fā)揮重要作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)的對真武湯治療腎纖維化的主要成分、潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行研究，表明真武湯中山奈酚、β-谷甾醇、芍藥苷、茯苓酸、麥角甾醇過氧化物等成分為真武湯的主要藥效成分，其發(fā)揮抗纖維化的作用主要通過TNF、AKT1、

MAPK8、IL6、CASP3、JUN、BCL2、TGFB1、CASP8、ICAM1、NOS3 等關(guān)鍵核心靶點(diǎn)參與AGE-RAGE 信號通路、Insulin resistance 信號通路、TNF-α信號通路及其他相關(guān)聯(lián)的信號通路如NF-kappa B 信號通路、TGF-β信號通路通過調(diào)節(jié)胰島素受體活性、氧化應(yīng)激和纖維化因子的表達(dá)水平干預(yù)疾病。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對真武湯治療腎纖維化的有效成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路進(jìn)行初步探索，可為后期真武湯治療腎纖維化作用機(jī)制深入研究提供參考。盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)性與整體性思想與中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)殊途同歸，但尚不能完全的揭示成分-靶點(diǎn)-通路的作用特點(diǎn)，并且本研究的藥效成分是基于已有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測，因此研究所得的結(jié)果還需在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。