水凝膠對(duì)腹腔開放下小腸氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

周 翔，趙澤玉，郭正昌，李大路，張宗耀，周 波，常家聰

在過去20年，腹腔開放療法(open abdomen technique)挽救了大量創(chuàng)傷及外科危重患者，已成為救治腹部創(chuàng)傷、復(fù)雜腹腔感染和重癥壞死性胰腺炎合并腹腔間隔室綜合征的重要手段。腹腔開放后，腹腔內(nèi)腸管暴露于空氣中，會(huì)引起水、電解質(zhì)及蛋白質(zhì)的大量丟失，機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡；腹腔臟器，主要是腸管繼發(fā)性缺血再灌注損傷，導(dǎo)致腸瘺和腹腔感染。因此，針對(duì)開放的腹腔，人們采用了各種方法臨時(shí)關(guān)閉腹腔以期減少并發(fā)癥的發(fā)生以及腹壁的無限制開放。然后，這些暫時(shí)性關(guān)腹措施，不論是早期的滌綸布和聚丙烯網(wǎng)片，還是目前常用的Wittmann補(bǔ)片和負(fù)壓封閉引流，都存在著共同的問題：無法有效保護(hù)腹腔內(nèi)臟器。本課題組前期制備了殼聚糖-聚乙二醇-酪胺水凝膠，其具有良好的生物相容性和生物黏附性，可以保護(hù)腸管和促進(jìn)創(chuàng)面愈合。因其可以原位快速成膠，封閉開放的腹腔，所以該研究旨在探討水凝膠是否能保護(hù)腸管氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1

.

1

.

1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡健康SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量230～280 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)。

1

.

1

.

2

主要試劑 硫代巴比妥酸(TBA, T5500MSDS)購自美國Sigma-Aldrich LLC公司。乙酸和檸檬酸為優(yōu)級(jí)純，乙酸鈉為色譜級(jí)，均為天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心產(chǎn)品。氫氧化鈉為北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na)為分析純，美國JTBaker公司產(chǎn)品。甲醇為色譜純，北京DIKMA公司產(chǎn)品。丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、磷酸二氫鉀、對(duì)硝基苯氯甲酸酯、聚乙二醇、酪胺、殼聚糖、辣根過氧化物酶和雙氧水購自北京碧云天生物技術(shù)公司。

1

.

1

.

3

主要儀器 全波長酶標(biāo)儀、高效液相色譜儀系統(tǒng)(美國賽默飛公司)，低溫高速離心機(jī)(上海菲恰爾公司)，美國Agilent真空固相萃取裝置和美國Varian BondElutC18(500mg)固相萃取小柱。

1.2 方法

1

.

2

.

1

動(dòng)物模型制備 采用如下方法建立大鼠腹腔間隔室綜合征模型：手術(shù)區(qū)域常規(guī)備皮、消毒和鋪巾，取腹部正中切口，結(jié)扎遠(yuǎn)端盲腸，用18G針穿破結(jié)扎盲腸壁，擠出少許糞便關(guān)腹。腹部正中右側(cè)1 cm處穿刺置入一2 mm導(dǎo)管，將氮?dú)庾⑷氪笫蟾骨徊⒕S持3.325 kPa腹內(nèi)壓4 h。隨后將大鼠分為3組：殼聚糖-聚乙二醇-酪胺分子水凝膠組(CPT組)、暫時(shí)性關(guān)腹組(TAC組)、假手術(shù)組(Sham組)。CPT組：大鼠腹腔開放后，將殼聚糖-聚乙二醇-酪胺分子水凝膠貼合裸露腸壁，后用聚丙烯網(wǎng)片臨時(shí)關(guān)腹；TAC組：腹腔開放后，隨即用聚丙烯網(wǎng)片縫合關(guān)閉腹腔，適時(shí)對(duì)網(wǎng)片表面滴加生理鹽水；Sham組：打開腹腔后隨即關(guān)閉腹腔。

1

.

2

.

2

觀察氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞 在腹腔開放后的4 h時(shí)，刮取CPT組和TAC組大鼠末端回腸黏膜組織，并用熒光染料對(duì)組織進(jìn)行染色，然后用熒光顯微鏡觀察，拍攝相關(guān)圖片。

1

.

2

.

3

TBA法測(cè)定MDA的水平 腹腔開放后4、8、24 h，取大鼠小腸組織，勻漿器中研磨，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。配制MDA檢測(cè)工作液。取上清液加試劑在 100 ℃水浴中保溫 60 min 后(蓋緊，防止水分散失)，置于冰浴中冷卻，常溫6 300 r/min離心 10 min。 吸取 200 μl 上清液于微量玻璃比色皿或 96 孔板中，測(cè)定各樣本在 520 nm 處的吸光度值。測(cè)得CPT組、TAC組、Sham組各波長處的吸收度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出MDA的濃度。

1

.

2

.

4

ELISA法測(cè)定8-羥脫氧鳥苷(8-OHDG)的水平 腹腔開放后4、8、24 h，取大鼠小腸組織，勻漿器中研磨，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl。加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100 μl，空白孔除外。溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度(OD)值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本8-OHDG濃度。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠具有很好的氧化應(yīng)激保護(hù)作用

為了驗(yàn)證水凝膠是否可以保護(hù)腹腔開放后小腸的氧化應(yīng)激狀態(tài)，采用免疫組織熒光法觀察末端回腸的氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示：腹腔開放后4 h，CPT組的氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞數(shù)量明顯少于TAC組(圖1)。

圖1 腹腔開放后4 h末端回腸的氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞數(shù)量A：CPT組；B：TAC組；A1、B1：×10；A2、B2：×20

2.2 腹腔開放后4 h三組小腸MDA和8-OHDG水平的差異

為了驗(yàn)證不同組間的MDA和8-OHDG水平是否有差異，采用TBA法和ELISA法檢測(cè)腹腔開放后4 h小腸勻漿的MDA和8-OHDG水平(圖2)。結(jié)果顯示，三組MDA、8-OHDG差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MDA：

F

=6.716,

P

<0.05；8-OHDG：

F

=7.234，

P

<0.05)。LSD-

t

檢驗(yàn)顯示CPT組和TAC組的MDA和8-OHDG水平均大于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。CPT組小腸組織的MDA和8-OHDG水平均小于TAC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。

圖2 腹腔開放后4 h小腸組織的MDA和8-OHDG的濃度比較與Sham組比較：*P<0.05；與TAC組比較：#P<0.05

2.3 腹腔開放后不同時(shí)間點(diǎn)小腸MDA和8-OHDG水平的差異

為了驗(yàn)證不同時(shí)間的MDA和8-OHDG水平是否有差異，采用TBA法和ELISA法檢測(cè)腹腔開放后4、8、24 h小腸勻漿MDA和8-OHDG水平(圖3)。經(jīng)過方差分析和LSD-

t

檢驗(yàn)，在CPT組中，腹腔開放后8、24 h小腸的MDA和8-OHDG水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MDA組：

F

=8.234，

P

<0.05；8-OHDG組：

F

=4.518，

P

<0.05)。腹腔開放后8 h，小腸的MDA和8-OHDG水平恢復(fù)至假手術(shù)組水平(圖3A)。在TAC組，腹腔開放后8、24 h小腸的MDA和8-OHDG也低于4 h(

P

<0.05)，但高于CPT組和假手術(shù)組(圖3B)。

圖3 腹腔開放后不同時(shí)間點(diǎn)MDA和8-OHDG水平變化A：CPT組腹腔開放后4、8、24 h小腸的MDA和8-OHDG水平；B：TAC組腹腔開放后4、8、24 h小腸的MDA和8-OHDG 水平；與同一指標(biāo)4 h比較：*P<0.05

3 討論

創(chuàng)傷、感染及腹部外科大手術(shù)均有可能導(dǎo)致腹壁的相對(duì)和絕對(duì)缺損，常使腹腔處于被動(dòng)開放狀態(tài)。此外，在急診普通外科和血管外科，為治療腹腔感染、腹腔大血管破裂及重癥急性胰腺炎合并的腹腔間隙綜合征常需采用主動(dòng)的腹腔開放。腹腔開放后，原有的生理穩(wěn)態(tài)被打破，于是產(chǎn)生了一系列并發(fā)癥，如水電解質(zhì)和蛋白質(zhì)丟失、腸瘺、腹腔膿腫等。這也就要求盡早關(guān)閉開放的腹腔，恢復(fù)生理穩(wěn)態(tài)。最理想的結(jié)果就是筋膜關(guān)閉或腹壁缺損修復(fù)，結(jié)構(gòu)上恢復(fù)腹壁連續(xù)性，腹腔生理功能進(jìn)而得以恢復(fù)。然而，再次探查、臟器水腫、腹壁回縮等眾多伴隨因素的存在，客觀上不允許早期關(guān)閉筋膜或腹壁缺損修復(fù)，這使得腹腔一直處于開放狀態(tài)。

針對(duì)開放的腹腔，采用了多種方法，即暫時(shí)性關(guān)腹措施(TAC)，臨時(shí)封閉腹腔以期可以減少腹腔開放后各種并發(fā)癥。然而，不論是早期的滌綸布和聚丙烯網(wǎng)片，還是目前常用的Wittmann補(bǔ)片和負(fù)壓封閉引流(NPWT)，因其均為生物惰性材料，都存在著共同的問題：治療時(shí)間長和腸瘺形成率高。這些問題也成為阻礙后期腹壁缺損修復(fù)或腹腔開放療法臨床應(yīng)用的關(guān)鍵性技術(shù)難題。在腹腔開放早期，如何保護(hù)裸露臟器和促進(jìn)創(chuàng)面快速修復(fù)是迫切需要解決的問題。

腹腔開放療法能夠使腹腔內(nèi)的高壓環(huán)境解除，可能繼發(fā)出現(xiàn)腹腔內(nèi)臟器缺血再灌注，或可加重臟器氧化應(yīng)激損傷，那么腸管保護(hù)在這里就顯得尤為重要。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，曾嘗試過多種補(bǔ)片如Wittmann補(bǔ)片、聚丙烯網(wǎng)片等暫時(shí)性關(guān)腹方法。因補(bǔ)片表面干燥、保水性差、腹膜仿生差、磨損腸壁、無法維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等特點(diǎn)，所以效果不甚理想。解決方案之一就是為開放的腹腔設(shè)計(jì)一層保護(hù)膜。這種保護(hù)膜應(yīng)能最大程度仿生腹膜，恢復(fù)腹腔內(nèi)環(huán)境，解決腹腔開放的五大病理生理難題：水分蒸發(fā)、通暢引流、腸道功能恢復(fù)、腸瘺形成和腹壁缺損；同時(shí)又可提供生物活性信號(hào)和支架，有利于新生血管和細(xì)胞長入。水凝膠材料由于具有良好的保水能力和“濕”、“潤”的表面環(huán)境；并且能改善關(guān)腹材料與腸壁接觸的微環(huán)境和減少腸壁磨損和損傷等特點(diǎn)，因此本研究選用可以原位成膠并且具有腸管黏附性的CPT水凝膠進(jìn)行了研究。

免疫組織熒光圖表明相對(duì)于TAC組，CPT組具有較低的氧化應(yīng)激損傷水平。缺養(yǎng)和氧化應(yīng)激產(chǎn)生的線粒體呼吸爆發(fā)，呼吸爆發(fā)的直接產(chǎn)物就是反應(yīng)性氮自由基(RNS)、氧自由基(ROS)等一系列氧相關(guān)的自由基，是能活躍結(jié)合還原性物質(zhì)含有自由電子基團(tuán)的氧自由基。細(xì)胞的生命組成單位包括：多糖、脂質(zhì)、蛋白、水、遺傳物質(zhì)、無機(jī)鹽，這里除了無機(jī)鹽、水無法被強(qiáng)氧化劑自由基氧化外，幾乎都是自由基攻擊的對(duì)象。由于特異性的要求，本研究選取了脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)的氧化產(chǎn)物作為研究對(duì)象。MDA是脂質(zhì)的過氧化評(píng)估指標(biāo)，8-OHDG是遺傳物質(zhì)的過氧化評(píng)估指標(biāo)。MDA 和8-OHDG的濃度差異在量化細(xì)胞損傷中均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為腹腔開放條件(腹腔間隙綜合征)下腸氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)。因此通過測(cè)量MDA和8-OHDG濃度來觀測(cè)小腸氧化應(yīng)激損傷的情況。在腹腔開放情況下，腹腔間隙綜合征解除、缺血再灌注恢復(fù)、局部微環(huán)境破壞等狀況除了會(huì)對(duì)常見的漿膜造成侵蝕外，還會(huì)進(jìn)一步加重腸道氧化應(yīng)激水平。課題組發(fā)現(xiàn)腹腔開放組(包括TAC組和CPT組)腸道內(nèi)的氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-OHDG和MDA氧化應(yīng)激水平高于Sham組，同時(shí)在CPT組氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞更少。所以CPT水凝膠能減少腹腔開放后小腸氧化應(yīng)激損傷。

水凝膠作為一種富含羥基和氨基的仿生大分子材料，具有很好的保水功能，能模仿腹膜濕潤的環(huán)境，保護(hù)腸管表面的微環(huán)境，使其能很好地進(jìn)行物質(zhì)交換。同時(shí)該材料能降低自由水比例，不利于細(xì)菌的生長和繁殖，有一定的抑菌作用。另外，該材料因其濕潤的接觸表面，更潤滑，不易對(duì)腸道造成損傷。該材料因其疏松多孔類似活性炭的結(jié)構(gòu)，能夠開發(fā)吸附功能。水凝膠因以上優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床。因此，可以得出水凝膠對(duì)腹腔開放下小腸氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。作為一種新型的生物材料，水凝膠具有良好的仿生性，可以注射，原位快速成膠，是臨床治療上極具應(yīng)用潛力的生物材料。