皮膚軟組織感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCC mec分型和同源性分析

汪軒軒，黃 穎，胡媛媛，陳 鶴，王中新，徐元宏

皮膚軟組織感染(skin and soft tissue infections，SSTI)是化膿性病原菌感染表皮、真皮及皮下組織引起的炎癥性疾病，包括從淺表性感染至壞死性感染。有研究表明壞死性SSTI截肢率為12%～20%，死亡率為6%～33%。引起SSTI最常見致病菌是金黃色葡萄球菌，其中25%為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。MRSA中的葡萄球菌染色體mec盒(SCC mec)是一個可移動的遺傳元件，包含兩個基本的遺傳成分(mec基因復合體和ccr基因復合體)。根據(jù)mec和ccr基因復合體組合SCCmec可分為 I～V型。SCC mec中含有多種耐藥基因和位于mec基因復合體的甲氧西林耐藥(mecA)基因，與MRSA的傳播和多重耐藥密切相關。通過SCC mec類型可區(qū)分醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA)和社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)。因此，SCCmec分型做為一種分子工具是了解MRSA分子流行病學的基礎?，F(xiàn)對SSTI住院患者分離的MRSA菌株進行SCC mec分型并了解其耐藥情況，同時分析菌株間的同源性，為臨床合理規(guī)范使用抗生素及醫(yī)院感染控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2019年6月-2020年9月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科保存的從SSTI患者中分離的MRSA共44株，剔除同一患者相同部位分離的重復菌株，其中HA-MRSA 40株，CA-MRSA 4株。陰性質控菌株為ATCC25923，陽性質控為ATCC43300。CA-MRSA的判斷標準根據(jù)《耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染防治專家共識》：從門診、住院48 h內的患者中分離的MRSA菌株，既往無MRSA感染和定植病史，無留置導管或經(jīng)皮的醫(yī)療裝置，無血透和手術史，1年內未住入醫(yī)院、養(yǎng)老院。不符合上述標準判斷為HA-MRSA。

1.2 儀器與試劑

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主要儀器 東勝龍ETC 811基因擴增儀(蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司);MULTIFUGE X1R高速冷凍離心機、HERAcell-240i CO培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技公司); DYY-60型電泳儀(北京六一生物科技有限公司);JS-2000紫外線凝膠成像儀(上海培清科技有限公司); Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析儀、Vitek MS質譜儀(法國梅里埃公司)。

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主要試劑 Mlutiplex PCR Kit(德國QIAGEN生物公司);2×Pro Taq Master Mix含染料、GL DNA marker 2000、GoldView核酸凝膠染料、瓊脂糖凝膠(湖南艾科瑞生物有限公司);哥倫比亞血平板(合肥天達診斷試劑有限公司); GL DNA marker 1000(山東思科捷生物技術有限公司)；藥敏紙片(英國Oxoid公司);引物購自上海生工生物公司。

1.3 方法

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MRSA鑒定及藥敏分析 菌株復蘇后四區(qū)劃線接種在哥倫比亞血平板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，挑取單個菌落用Vitek MS質譜儀重新鑒定。藥敏結果采用頭孢西丁藥敏紙片擴散(K-B)法和革蘭陽性球菌藥敏卡片在Vitek 2 Compact儀器上分析。結果判讀根據(jù)2018年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的執(zhí)行標準。

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提取模板DNA 挑取單個菌落5～8個于200 μl無菌去離子水中，在漩渦混合器上振蕩混勻20 s,置于干式恒溫器中100 ℃加熱20 min，高速離心機15 000 r/min離心10 min,取100 μl上清液轉移至新的無菌EP管中即為DNA模板。

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檢測mecA基因 采用PCR方法檢測模板DNA的mecA基因，引物序列參考文獻見表1。反應體系為25 μl，包括2×Pro Taq Master Mix 12.5 μl，上下游引物(10 μmol /L)各1 μl，模板DNA 4 μl,無菌去離子水6.5 μl。反應條件為94 ℃ 30 s預變性;98 ℃ 10 s變性、50 ℃ 30 s退火、72 ℃ 1 min退火,35個循環(huán)；72 ℃ 2 min最終延伸。PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外凝膠成像儀下觀察，陽性菌株確證為MRSA。

表1 mec A基因和SCC mec分型引物序列表

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SCC mec分型 采用多重PCR方法對模板DNA進行SCC mec分型，各引物序列參考文獻見表1。反應體系為25 μl，包括2×QIAGEN Mlutiplex PCR Master Mix 12.5 μl,引物混合液(2 μmol /L)2.5 μl，模板DNA 4 μl，無菌去離子水6 μl。反應條件為95 ℃ 15 min預變性;94 ℃ 30 s變性、57 ℃ 90 s退火、72 ℃ 90 s延伸,35個循環(huán)；72 ℃ 2 min最終延伸。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外凝膠成像儀下觀察結果。

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基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI

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TOF MS)同源性分析 菌株復蘇后接種在哥倫比亞血平板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，無菌接種環(huán)挑取少量菌落厚薄均勻涂布于靶板上，在菌膜未干燥時用1 μl CHCA基質液均勻覆蓋菌膜表面，自然晾干后置于Vitek MS質譜儀上采用RUO模式檢測。通過LaunchPad獲得質譜，結果實時發(fā)送至SARAMIS,并通過VITEK MS SARAMIS Premium軟件查看。將獲得的圖譜導入圖譜數(shù)據(jù)庫進行聚類分析，相似度< 70%的結果認為是不同的質譜型別。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用WHONET 5.6軟件分析藥物敏感性試驗結果，SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，卡方檢驗確切概率法比較不同SCC mec類型MRSA耐藥率的差異，

P

<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SSTI患者一般臨床資料

44例SSTI患者中男性30例，女性14例，男女比例為2.1 ∶1。年齡為10個月～80歲，平均(42.59±21.96)歲，感染類型中術后切口感染17例(38.63%)、燒傷感染14例(31.82%)、皮疹和皮膚膿皰瘡7例(15.90%)、外傷創(chuàng)面感染3例(6.82%)、骨髓炎2例(4.54%)、受壓區(qū)壓瘡1例(2.27%)。

2.2 mecA基因檢測結果

44株MRSA進行經(jīng)PCR擴增后mecA基因均為陽性，結果見圖1。

圖1 mecA檢測結果M：GL DNA Marker 2000；1～6：隨機抽取的菌株標本；7：陽性質控ATCC43300；8：陰性質控ATCC25923

2.3 SCC mec分型結果

經(jīng)過多重PCR擴增后共分出Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa三種類型。其中Ⅱ型5株(11.36%)、Ⅲ型12株(27.27%)、Ⅳa型8株(18.18%)、未分型19株(43.18%)，各分型電泳結果見圖2。已分型的25株MRSA中包含22株HA-MRSA和3株CA-MRSA，HA-MRSA中Ⅱ型5株(22.73%)、Ⅲ型11株(50.00%)、Ⅳa型6株(27.27%)，CA-MRSA中Ⅲ型1株(33.33%)、Ⅳa型2株(66.67%)。

圖2 SCC mec檢測結果A、B、C：SCC mec Ⅲ、Ⅱ、Ⅳa型電泳條帶；M:GL DNA Marker 1000；1～4：各型別隨機抽取的4株標本

2.4 MALDI-TOF MS同源性分析

通過VITEK MS SARAMIS Premium軟件對44株MRSA的蛋白圖譜進行聚類分析并構建發(fā)育樹。根據(jù)各菌株間相似度小于70%為不同類型的標準進行判別，44株MRSA分為兩大簇；21號菌株為一簇，其他43株標本為另一簇，結果見圖3，其中不同相似度的菌株科室分布見表2。

表2 不同相似區(qū)間的菌株科室分布表

圖3 44株MRSAMALDI-TOF MS同源性分析

2.5 不同SCC mec類型的MRSA耐藥結果

不同SCC mec類型MRSA對青霉素、苯唑西林、頭孢西丁等β-內酰胺類抗生素均表現(xiàn)為耐藥，對利奈唑胺和萬古霉素均表現(xiàn)出敏感。3種類型的MRSA對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素和莫西沙星的耐藥率差異有統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 不同SCC mec類型MRSA的耐藥率(%)

3 討論

本研究44例住院患者中38.63%為術后切口，38.63%為燒傷感染，主要由于皮膚屏障破壞，創(chuàng)面微環(huán)境形成了感染的溫床，部分患者同時存在免疫力低下、糖尿病、慢性腎功能不全等高危因素。早期識別MRSA SSTI的高危人群并采取合理的治療措施至關重要。

SCC mec基因目前主要分為 Ⅰ～Ⅴ型，本研究結果以Ⅲ型(27.27%)為主，其次為Ⅳa型(18.18%)和Ⅱ型(11.36%)，與國內相關文獻報道一致。但國內部分地區(qū)和日本以Ⅱ型為主，說明不同國家和地區(qū)有較大的差異。本研究中未分型菌株占43.18%，高于國內部分報道，可能與以下原因有關：① 由于部分菌株保存條件不當導致耐藥基因缺失；② 隨著不同抗菌藥物的使用導致SCCmec出現(xiàn)新的型別或者亞型，目前實驗條件尚未檢測到，需要實驗進一步驗證。

本研究中共有HA-MRSA 40株，CA-MRSA 4株，說明本院以HA-MRSA感染為主。雖然研究表明HA-MRSA以SCCmec Ⅰ-Ⅲ型居多，CA-MRSA以SCCmec Ⅳ、V型居多，但本院SSTI患者中HA-MRSA Ⅳa型的比例(27.27%)超過了Ⅱ型(22.73%)，CA-MRSA中也出現(xiàn)了Ⅲ型(33.33%)，可見隨著患者在社區(qū)和醫(yī)院之間不斷流動，HA-MRSA 與CA-MRSA 差異逐漸縮小。我國也有文獻報道由Ⅳ、V 型引起的醫(yī)院獲得性感染正逐年增加，有超過由Ⅲ型引起醫(yī)院獲得性感染的趨勢。其機制尚不明確，可能和以下原因有關：① Ⅳ、V型攜帶的耐藥基因小，更容易對抗生素做出適應性改變；② Ⅳ、V型更有可能攜帶殺白細胞素(PVL)基因；③ Ⅳ、V型和 Ⅰ-Ⅲ型菌株相比，可表達更高水平的RNA Ⅲ，它是輔助基因調節(jié)系統(tǒng)(Agr)效應器，調節(jié)多種毒素的表達，在未接觸抗生素的情況下保持毒力，接觸抗生素后可用Agr活性來換取對甲氧西林的耐藥性。

本研究顯示SCCmec Ⅲ型和Ⅱ型總體耐藥率較高，Ⅳa型相對較低，三種類型的MRSA對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素和莫西沙星的耐藥率差異均有統(tǒng)計學意義。原因是Ⅱ型和Ⅲ型由于分子結構長，攜帶多種耐藥基因呈多重耐藥性，而 HA-MRSA中的Ⅳ型除 mecA 以外攜帶其他耐藥基因較少。

本研究采用MALDI-TOF MS進行同源性分析將44株MRSA分為兩大簇，其中43株均在一簇，僅21號菌株在另一簇，表明本院SSTI患者中的MRSA具有高度同源性。本研究中有7株MRSA相似度達到100%，并分布在不同病區(qū)，說明可能存在同一菌株在不同病區(qū)之間相互傳播。從表2可以看出在不同相似區(qū)間，來自燒傷科的菌株均多于其他病區(qū)，因此燒傷科更應提高醫(yī)務人員和患者控制感染的意識，嚴格執(zhí)行消毒隔離制度，加強病區(qū)病原菌監(jiān)測，避免細菌院內爆發(fā)感染。

4株CA-MRSA編號分別為33、14、29、3，其中33號菌株在70%～80%相似區(qū)間，14號菌株在80%～90% 相似區(qū)間，29號和3號菌株在90%～100%相似區(qū)間。查閱病史29號、3號菌株患者近兩個月均有規(guī)律的醫(yī)療機構接觸史，可能是造成與HA-MRSA菌株相似度較高的原因。MALDI-TOF MS技術是基于蛋白質水平對菌株鑒定分析，對不同菌株間同源性分析迅速,為判斷是否發(fā)生院內感染提供依據(jù)。但其檢測受多種因素影響，目前利用MALDI-TOF MS進行同源性分析仍屬于研究階段。脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型通過檢測染色體上所有酶切位點的變化反映全部基因的相關性，被認為是基因分型的“金標準”。本研究中利用MALDI-TOF MS同源性分析后期仍需要PFGE分型驗證，以便進一步探討MALDI-TOF MS技術在細菌同源性分析中的價值。