合成鋰皂土-海藻酸鈉復(fù)合屏障膜的制備及研究

程東東，周 璞，邢 新，鄒多宏,2

目前臨床上應(yīng)用的可吸收引導(dǎo)骨再生 (guided bone regeneration，GBR) 膜通常受到機(jī)械強(qiáng)度弱、力學(xué)性能不足的限制，易發(fā)生穿孔和破裂。海藻酸鈉 (sodium alginate，SA) 是組織工程支架的常用材料，能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性骨缺損的骨再生，是GBR的合適材料。合成鋰皂土 (Laponite?, LAP) 除了作為粘土材料應(yīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)藥和化妝品，還可作為開發(fā)新的納米醫(yī)學(xué)功能材料，成為骨組織工程應(yīng)用的理想選擇。有序的“磚-泥”微觀結(jié)構(gòu)賦予了貝類優(yōu)異的抗拉強(qiáng)度、剛度和韌性，受此啟發(fā)，引入無機(jī)納米填料制備類似特殊的層狀微結(jié)構(gòu)，成為近十年來提高“軟基”聚合物力學(xué)性能的最常用方法。該研究采用噴涂組裝方法構(gòu)建仿貝殼結(jié)構(gòu)的二元體系LAP -SA復(fù)合膜，通過測試該復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度及其對NIH/3T3增殖的影響，探討其應(yīng)用于組織工程屏障膜的可能性。

1 材料與方法

1.1 合成材料

SA[粘度(10 g/L,20 ℃)/(Pa·s)≥0.02,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司]；LAP(東莞市樟木頭鎮(zhèn)佳桐塑膠原料經(jīng)營部)；無水氯化鈣(美國Sigma-Aldrich 公司)。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM、胰酶消化液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gbico 公司)；CCK-8試劑盒(日本株式會社同仁化學(xué)研究所)；力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī) (5565A，美國英斯特朗公司)；CO孵箱 (美國Thermo 公司)；掃描電鏡 (Supra40，德國蔡司公司)；透射電鏡 (HT7700，日本日立公司)；X 射線衍射儀 (X'Pert3 Powder，荷蘭帕納科公司)；傅里葉變換紅外光譜儀 (Nicolet 8700，美國熱電尼高力儀器公司)；酶標(biāo)儀 (美國Bio-tek 公司)；高溫高壓滅菌鍋 (HVE-50，日本Hirayama 公司)。

1.3 原料配制

分別配制質(zhì)量濃度為 2% 的SA溶液及LAP溶液。分別稱取 2 g 原料粉末溶于 98 ml 去離子水中，室溫下攪拌直至完全溶解分散。

1.4 復(fù)合薄膜的制備

首先制備LAP與SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1 ∶10的復(fù)合膜(設(shè)為1組)，取 1 ml LAP 溶液與 10 ml SA溶液混勻，磁子攪拌 0.5 h 直至完全分散，真空箱內(nèi)除氣泡后通過熱噴涂組裝方法，將混合液噴涂到熱的基材上，待水蒸發(fā)后干燥成膜。同理分別制備 LAP 與SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為3 ∶10、5 ∶10、7 ∶10、9 ∶10 的復(fù)合膜和純SA膜 (圖1)，分別命名為 3、5、7、9組和0組；隨后取抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜用 Ca螯合后作為Ca組，共6組。同時(shí)為后面材料表征，將抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組直接設(shè)為復(fù)合膜組，將制備的純SA膜設(shè)為純SA膜組。

圖1 LAP-SA復(fù)合膜制備過程示意圖與展示圖

1.5 力學(xué)測試

在室溫下將每組薄膜裁剪為長 50 mm、寬 4 mm的測試樣品，并用螺旋測微儀測量每組樣品厚度，通過力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)以 0.1 mm/s的拉伸速度直至樣品斷裂，記錄其抗壓強(qiáng)度，每組樣品重復(fù)測試 6 次。取抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組，重新制備測試樣品后浸泡于 0.5 mol/L的氯化鈣溶液中 5 s，室溫下自然干燥后，以同樣方法測試抗拉強(qiáng)度。最后繪制出相應(yīng)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和斷裂應(yīng)力值表。

1.6 樣品表征

取抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組和純SA膜組，采用掃描電鏡觀察兩組膜截面的微觀結(jié)構(gòu)。取 LAP 稀釋溶液滴在透射銅網(wǎng)表面，待干燥后采用透射電鏡觀察 LAP 納米片的形貌。取少量 LAP 納米片、SA膜和復(fù)合膜分別平鋪于觀測臺上，采用X射線衍射儀分析各組成分。研磨 LAP 納米片、復(fù)合膜及SA膜，采用傅立葉變換紅外光譜儀分析各成分。

1.7 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

取抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組和純SA膜組，用0.5 mol/L的CaCl溶液預(yù)處理 5 s 后 PBS 洗凈。制備直徑為 6 mm 的圓形復(fù)合膜和純SA膜薄片，每組10個(gè)，高溫高壓滅菌。細(xì)胞系選用鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (NIH/3T3細(xì)胞，由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供)，以8×10/孔接種，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5個(gè)復(fù)孔 (空白對照組僅接種NIH/3T3)，37 ℃、5%CO培養(yǎng)。24、48 h后將CCK-8試劑與DMEM按1 ∶9 比例混合，每孔加100 μl，37 ℃、5%CO培養(yǎng) 2 h。用酶標(biāo)儀在 450 nm 處讀取吸光度值 (optical density, OD)。

2 結(jié)果

2.1 各組膜抗拉強(qiáng)度的比較

如圖2所示各組膜樣品的應(yīng)力-應(yīng)變曲線及斷裂應(yīng)力值。隨著 LAP與SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)比的增加，LAP-SA復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度也隨之增加，當(dāng) LAP與SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為5 ∶10時(shí)，即5組復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度達(dá)最大，之后繼續(xù)增加 LAP 含量，LAP-SA復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度開始下降，各組總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (

F

=77.385，

P

<0.001)。且5組膜樣品用 Ca螯合后，即Ca組的抗拉強(qiáng)度相比螯合前有一定增加且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同LAP-SA復(fù)合膜組和SA膜組樣品的抗拉強(qiáng)度比較A:各組樣品的應(yīng)力-應(yīng)變曲線；B:各組樣品的斷裂應(yīng)力值；與0、1、3、7、9組比較： *P<0.05

2.2 樣品表征

LAP與SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為 5 ∶10 時(shí)，掃描電鏡下可見復(fù)合膜厚度約為 30 μm，截面呈明顯的有序?qū)訝罱Y(jié)構(gòu) (圖3)。透射電鏡示 LAP 納米片呈薄片狀，透光性和分散性良好(圖4)。X 射線衍射儀、傅里葉變換紅外光譜儀分析證實(shí)復(fù)合膜中存在LAP(圖5)。

圖3 掃描電鏡下觀察樣品截面的微觀結(jié)構(gòu)×10 000A：純SA膜組的截面；B：復(fù)合膜組的截面

圖4 LAP納米片不同倍數(shù)下的透射電鏡觀察A:×10 000; B:×20 000; C:×50 000; D:×100 000

圖5 LAP-SA復(fù)合膜的組成成分分析A：復(fù)合膜的X射線衍射結(jié)果;B:復(fù)合膜的傅里葉變換紅外光譜結(jié)果

2.3 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖6所示，選取LAP與SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為5 ∶10復(fù)合膜作為復(fù)合膜組進(jìn)行細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示NIH/3T3與空白對照組、純SA膜組和復(fù)合膜組共培養(yǎng)的24、48 h內(nèi)，相同時(shí)間點(diǎn)各組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 各組膜材料與NIH/3T3共培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

3 討論

臨床常用的GBR膜可分為不可吸收性膜和生物可吸收性膜。然而，不可吸收性膜在創(chuàng)口愈合過程中存在軟組織開裂，導(dǎo)致屏障膜暴露的風(fēng)險(xiǎn)，可能造成創(chuàng)口感染甚至需要提前將其取出，從而影響GBR的再生效果；同時(shí)，在新骨形成之后必須實(shí)施第2次手術(shù)，將不可吸收性膜取出，從而不可避免地增加患者的痛苦和費(fèi)用,并增加并發(fā)癥發(fā)生的概率。生物可吸收性膜主要由可降解的合成或天然聚合物組成，無需二次手術(shù)，并且很少發(fā)生軟組織開裂等并發(fā)癥，但屏障膜的機(jī)械強(qiáng)度不足會導(dǎo)致成骨效果不確定，如臨床上應(yīng)用廣泛的Bio-Gide及其他可吸收膜的抗拉強(qiáng)度均低于100 MPa。

因此，本研究擬制備一種新型可代謝高機(jī)械性能GBR膜。藻酸鹽是一種天然存在的陰離子聚合物，其具有良好的生物相容性、低毒性，且成本相對低廉，以及通過添加二價(jià)陽離子(如Ca) 可發(fā)生凝膠化等特性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被大量研究。然而，由于該類聚合物在生理?xiàng)l件下的不穩(wěn)定性和較差的機(jī)械性能限制了其臨床應(yīng)用。LAP是一種人工合成的可生物降解的層狀硅酸鹽，具有易于大量生產(chǎn)，廉價(jià)易得，純度、組成和晶體尺寸均可控等優(yōu)勢，此外由于其納米材料的層狀結(jié)構(gòu)，具有納米晶體組成的附加優(yōu)勢，如較高的比表面積、吸附能力、表面反應(yīng)性及陽離子的交換能力，因此能夠作為具有流變特性的改性劑和成膜劑在技術(shù)層面廣泛應(yīng)用。其可通過帶負(fù)電荷表面和帶正電荷邊緣與生物大分子發(fā)生多種物理結(jié)合，已有多個(gè)研究表明，向聚合物網(wǎng)絡(luò)中引入LAP納米顆粒可以大大提高復(fù)合物的機(jī)械性能。同時(shí)，近年來的研究表明，LAP可以釋放Mg等離子，是一種極具潛力的骨修復(fù)材料，可以改善細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。Wang et al研究了LAP生物陶瓷在骨組織工程應(yīng)用中潛在的適用性，其結(jié)論顯示LAP生物陶瓷具有良好的生物安全性以及表面親水性和蛋白質(zhì)吸附活性，同時(shí)體內(nèi)骨愈合效果良好，在骨組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

因此，本課題組擬向SA體系中加入LAP作為物理交聯(lián)劑以及硅酸鹽填料來提高復(fù)合膜的機(jī)械性能和成骨誘導(dǎo)功能。為使納米晶體在體系中分散均勻，本課題組將混有LAP的SA懸浮溶液噴涂到熱的基材上，待水蒸發(fā)后便可形成有序的層狀微結(jié)構(gòu)。完成復(fù)合膜制備后便進(jìn)行力學(xué)抗拉強(qiáng)度測試，當(dāng)LAP與SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為5 ∶10時(shí)，復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度達(dá)到最大 (166.9±11.5) MPa。為了進(jìn)一步提高復(fù)合膜的機(jī)械性能，本課題組采用氯化鈣浸泡的方法，使Ca與 SA 產(chǎn)生螯合作用從而穩(wěn)固復(fù)合膜，并測試其抗拉強(qiáng)度。結(jié)果顯示 Ca螯合后的抗拉強(qiáng)度可增加至 (178.0±14.8) MPa，相比螯合前有一定增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。