芹菜素對(duì)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖和成骨分化的影響

汪芹芹，徐 燕，胡韶光，劉珂珂， 桂雙英

牙周炎是導(dǎo)致牙周組織缺損的重要因素之一，隨著再生醫(yī)學(xué)和牙周組織工程的發(fā)展，以自體來(lái)源的種子細(xì)胞復(fù)合生物材料植入牙周病損部位，修復(fù)牙周缺損受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。但是，如何獲取大量種子細(xì)胞仍是一個(gè)難題。芹菜素(4′,5,7,-三羥基黃酮)是一種黃酮類化合物，無(wú)毒且無(wú)致突變性,還有抗炎、抗氧化、抗病毒活性及抗腫瘤等藥理作用。許周媚 等證實(shí)了芹菜素可顯著促進(jìn) MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化和礦化。人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞(human dental pulp mesenchymal stromal cells，hDPSCs)來(lái)源豐富、取材方便、免疫排斥小。該研究通過(guò)觀察黃酮類化合物芹菜素對(duì)hDPSCs增殖及骨向分化的影響，探討芹菜素用于輔助治療牙周病等骨缺損疾病的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

芹菜素(美國(guó)MCE公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國(guó)Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hylcone公司)；Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、JJT-900超凈臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(DMI3000B，德國(guó)Leica公司);Elx808U酶標(biāo)儀、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；茜素紅染液(美國(guó)Sigma公司)；Bio-oss骨粉(瑞士Geistlich公司)；掃描電鏡(Hitachi S-4800，日本日立公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

將適量芹菜素粉末溶于100 μl DMSO中獲得10 mmol/L芹菜素溶液，0.22 μm過(guò)濾除菌,-20 ℃保存。使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)新西蘭兔10只，雌雄不限，2.25～2.75 kg，日齡90～120 d。由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)。經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：LLSC20190122)。

1.4 hDPSCs分離培養(yǎng)與傳代

從安徽省口腔醫(yī)院口腔頜面外科收集健康的離體第3磨牙，患者年齡18～35(23.4±5.10)周歲。在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌PBS沖洗離體牙后劈開(kāi)牙冠，取出牙髓組織，剪碎成 1 mm×1 mm×0.5 mm大小組織塊移入6孔板中，每孔3～5小塊組織。蓋玻片蓋于組織塊上，輕輕加壓固定，防止氣泡產(chǎn)生影響細(xì)胞的爬出。于37 ℃、5% CO條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞從組織塊周圍爬出并達(dá)孔底面積60%左右時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5 hDPSCs的鑒定

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取第2代細(xì)胞，5個(gè)流式管，每管1×10個(gè)細(xì)胞。4 ℃下1 000 r/min離心5 min后去上清液，無(wú)菌PBS溶液洗滌1次。每管用100 μl PBS重懸細(xì)胞沉淀，按照抗體說(shuō)明書分別加入CD34、CD45、CD44、CD73抗體，設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照管，混勻后在4 ℃避光孵育30 min。PBS溶液洗滌2次后重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取第3代細(xì)胞，接種于3個(gè)96孔板，細(xì)胞密度為3×10/孔。分無(wú)芹菜素組及含不同濃度芹菜素(0.1、1、5、10、50 μmol/L)的實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后換液。分別在第1、2、3天按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值(optical density，OD)。使用GraphPad Prism 6作圖。

1.7 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)及成骨能力檢測(cè)

1

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7

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1

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的測(cè)定 成骨誘導(dǎo)液配置：10 μmol/L地塞米松，50 mg/L維生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。取第3代細(xì)胞，以5×10/孔的密度接種于3個(gè)96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分為無(wú)芹菜素組，成骨誘導(dǎo)液組(OIM)及含不同濃度芹菜素(0.1、1、5、10、50 μmol/L)的成骨誘導(dǎo)液組，24 h后換液，后每3 d換液，分別在培養(yǎng)的第1、4、7天按照堿性磷酸酯酶試劑盒具體流程進(jìn)行檢測(cè)。

1.7.2 ALP染色

根據(jù)上述結(jié)果，選擇濃度為5 μmol/L的芹菜素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組為DMEM液組；礦化組為成骨誘導(dǎo)液組；實(shí)驗(yàn)組為5 μmol/L芹菜素成骨誘導(dǎo)液組。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以5×10/孔的密度接種于6孔板，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，24 h后換成以上3組培養(yǎng)液，后每3 d換液，培養(yǎng)至14 d。按照ALP顯色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色。

1

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7

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3

茜素紅染色 實(shí)驗(yàn)分為3組：同ALP染色。將細(xì)胞接種于6孔板，5×10/孔，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，24 h換成以上3組培養(yǎng)液，后每3 d換液，培養(yǎng)至21 d；用4%的多聚甲醛溶液固定30 min；棄固定液，PBS清洗后，加入茜素紅染液，染色30 min。

1.8

Real-time

PCR

取第3代細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，5×10/孔，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，7 d后使用TRIzol裂解細(xì)胞，收集并檢測(cè)RNA濃度，濃度合適后使用Prime-ScriptRT Master Mix系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板，β-actin為內(nèi)參，上PCR儀檢測(cè)，全程嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書操作。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物及其序列

1.9 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1

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9

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1

骨粉與hDPSCs復(fù)合物的制備 選用第3代hDPSCs，以1×10/ml 細(xì)胞高濃度接種于骨粉支架上，放在50 ml離心管，低速震蕩，孵育2 h后轉(zhuǎn)移到24孔板，分別加入普通DMEM培養(yǎng)基和含5 μmol/L芹菜素的培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后掃描電鏡觀察復(fù)合物情況。

1

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9

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2

顯微鏡觀察復(fù)合物 用PBS洗滌2次，2.5%戊二醛溶液固定2 h后棄固定液，再用PBS洗滌3次，每次20 min；后續(xù)依次加入50%乙醇溶液、60%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液，每個(gè)濃度各洗20 min；然后加入100%乙醇溶液、洗2次，每次20 min。使用臨界點(diǎn)干燥儀干燥樣本，送樣進(jìn)行表面噴金，掃描電鏡下觀察。

1

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9

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3

動(dòng)物模型的制備 實(shí)驗(yàn)兔稱重后用3%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈麻醉(1 ml/kg),將兔子俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)，術(shù)前頭部剃毛，消毒，鋪巾，在顱頂正中部位切開(kāi)至骨膜，剝離骨膜，顯露骨面。剝離范圍向前至鼻根點(diǎn)處，向后方至枕骨結(jié)節(jié)。沿冠狀縫、矢狀縫將顱骨分成四個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域造直徑8 mm的圓形全層骨缺損；隨機(jī)分成4組：空白組、骨粉組、普通培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉組、5 μmol/L芹菜素培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉組。全程用滅菌生理鹽水降溫。術(shù)后肌注抗生素3 d，傷口涂抹紅霉素軟膏預(yù)防感染。

1

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9

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4

Micro-CT分析 術(shù)后4、8 周處死實(shí)驗(yàn)兔，方法為麻醉后空氣栓塞處死，取出顱骨缺損處組織，范圍在缺損外2 mm處，進(jìn)行Micro-CT掃描。掃描電流500 mA，電壓80 kv，掃描完成后將數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入系統(tǒng)中，進(jìn)行骨體積分?jǐn)?shù)分析，計(jì)算得出缺損區(qū)BV/TV值，并使用GraphPad Prism 6作圖。

1

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10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用

t

檢驗(yàn)，

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hDPSCs的培養(yǎng)與鑒定

原代細(xì)胞5 d左右開(kāi)始爬出，12 d左右達(dá)到孔底的60%左右。貼壁的hDPSCs大部分為長(zhǎng)梭形，與成纖維細(xì)胞類似(圖1)，流式細(xì)胞儀對(duì)hDPSCs進(jìn)行表面抗原的檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性表達(dá)CD44(93.98%)、CD73(97.47%)；陰性表達(dá)CD34(0.01%)、CD45(0.00%)。符合間充質(zhì)來(lái)源的特征(圖2)。

圖1 顯微鏡下原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞A:原代細(xì)胞 ×40 B:傳代后細(xì)胞 ×100

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.2 芹菜素對(duì)hDPSCs增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，0.1～10 μmol/L芹菜素對(duì)hDPSCs無(wú)明顯的毒性作用，48 h時(shí)，與其他對(duì)照組比較，5 μmol/L芹菜素對(duì)hDPSCs增殖有顯著促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=14.640,

P

<0.001)，72 h時(shí)促進(jìn)作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=33.843,

P

<0.001)。當(dāng)劑量達(dá)到50 μmol/L時(shí)，芹菜素具有抑制hDPSCs增殖的趨勢(shì)(圖3)。

圖3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況與0 μmol/L芹菜素組比較:***P<0.001

2.3 成骨誘導(dǎo)后成骨能力檢測(cè)結(jié)果

2

.

3

.

1

ALP活性表達(dá)情況 用ALP試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)1、4、7 d后的ALP活性水平。4 d時(shí)，與對(duì)照組比較，5 μmol/L芹菜素組細(xì)胞內(nèi)ALP活性顯著增高(

F

=310.121,

P

<0.001)；7 d時(shí)，OD值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=404.063，

P

<0.001)(圖4)。

圖4 ALP 定量分析與0 μmol/L芹菜素組比較：***P<0.001

2

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3

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2

茜素紅染色 經(jīng)過(guò)21 d的體外成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色可見(jiàn)5 μmol/L芹菜素成骨誘導(dǎo)液組形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量較礦化組多，對(duì)照組未見(jiàn)明顯的礦化結(jié)節(jié)形成(圖5)。

圖5 茜素紅染色A：對(duì)照組；B：礦化組；C：實(shí)驗(yàn)組

2

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3

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3

ALP染色 經(jīng)過(guò)14 d的體外成骨誘導(dǎo)后，鏡下可見(jiàn)5 μmol/L芹菜素組與礦化組較對(duì)照組均有藍(lán)紫色形成，且5 μmol/L芹菜素組顏色更深，范圍更大(圖6)。

圖6 ALP染色 ×100A：對(duì)照組；B：礦化組；C：實(shí)驗(yàn)組

2.4 Real-time PCR結(jié)果

7 d成骨誘導(dǎo)后，5 μmol/L芹菜素組hDPSCs成骨相關(guān)基因OCN的mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=25.747，

P

=0.005)；RUNX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=46.791,

P

=0.002)(圖7)。

圖7 芹菜素對(duì)hDPSCs成骨向分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響A:Runx2; B:OCN; 與空白組比較：*P<0.05；與礦化組比較：#P<0.05

2.5 細(xì)胞骨粉復(fù)合物掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察到hDPSCs與骨粉復(fù)合培養(yǎng)3 d，細(xì)胞可黏附于骨粉存活并且伸出偽足(圖8)。

圖8 掃描電子顯微鏡下觀察hDPSCs/Bio-oss復(fù)合物 ×6 130

2.6 兔顱骨造模

4個(gè)區(qū)域按照8 mm直徑造4個(gè)圓形全層骨缺損，用有刻度的探針測(cè)量直徑，依次放好移植物后縫合(圖9)。

圖9 術(shù)區(qū)大體觀A：顱骨缺損造模；B：完整取出骨組織塊；C：放置細(xì)胞支架復(fù)合物；D：縫合

2.7 Micro-CT 結(jié)果

術(shù)后4周骨體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)顯示，與普通培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉組比較，5 μmol/L芹菜素培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉組骨體積分?jǐn)?shù)較大，空白組及骨粉組無(wú)明顯新骨形成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=94.389,

P

<0.01);術(shù)后8周骨體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)顯示，5 μmol/L芹菜素培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉組新骨形成較普通培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=38.139,

P

<0.01)，空白組及骨粉組形成少量新骨(圖10)。

圖10 兔顱骨缺損區(qū)骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)與普通培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉組比較：**P<0.01

3 討論

組織工程的原理是在體外培養(yǎng)種子細(xì)胞，使種子細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖和分化能力，然后將它們與生物材料復(fù)合植入病變區(qū)域，以恢復(fù)缺損組織的形態(tài)和功能。牙周再生組織工程同樣如此，由于牙周炎，牙周缺損暴露于口腔中復(fù)雜的微生物環(huán)境中，不利于機(jī)體自身產(chǎn)生大量的種子細(xì)胞。因此體外刺激細(xì)胞增殖和分化是必要的。來(lái)源于牙髓的細(xì)胞具有無(wú)創(chuàng)傷、易于分離、增殖率高等優(yōu)勢(shì)，可以從第三恒磨牙、正畸牙或其他原因拔除的健康牙的牙髓組織中分離培養(yǎng)獲得，而不受倫理問(wèn)題的影響。選用hDPSCs，不僅有來(lái)源廣泛、取材簡(jiǎn)便、體外易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，且細(xì)胞來(lái)源于患者自身，更減少了免疫排斥反應(yīng)。有研究顯示芹菜素可以通過(guò)產(chǎn)生膜孔誘導(dǎo)真菌凋亡發(fā)揮顯著的抗真菌活性。也有研究表明芹菜素可通過(guò)減少氧化應(yīng)激抑制過(guò)度活躍的自噬和凋亡來(lái)緩解與年齡相關(guān)的骨骼肌的萎縮。以上研究證明了芹菜素的抗菌抗氧化的藥理作用，對(duì)于牙周炎患者來(lái)說(shuō)，抗菌抗炎治療也是必不可少的，因此，芹菜素的這些藥理作用更能保障牙周再生過(guò)程的順利進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)探討黃酮類化合物芹菜素對(duì)hDPSCs增殖和成骨分化的影響。通過(guò)改良組織塊法體外培養(yǎng)人的健康牙髓組織，獲得hDPSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD45、CD44、CD73，證明培養(yǎng)的細(xì)胞屬于間充質(zhì)來(lái)源。利用CCK-8法檢測(cè)不同濃度芹菜素(0.1、1、5、10、50 μmol/L)對(duì)hDPSCs增殖的影響，結(jié)果顯示5 μmol/L的芹菜素對(duì)hDPSCs增殖影響最優(yōu)，且與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001)；ALP活性水平是成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志之一，ALP活性測(cè)定結(jié)果顯示5 μmol/L芹菜素作用后活性顯著提高(

P

<0.001)；茜素紅染色結(jié)果顯示5 μmol/L芹菜素組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯增多，ALP染色鏡下見(jiàn)5 μmol/L芹菜素組顏色明顯加深。Real-time PCR結(jié)果顯示5 μmol/L芹菜素組RUNX2和OCN的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。

以上實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均證明5 μmol/L芹菜素可以促進(jìn)hDPSCs的增殖和成骨向分化，為了進(jìn)一步證明，將含有5 μmol/L芹菜素培養(yǎng)的hDPSCs與Bio-oss骨粉復(fù)合，置于兔顱骨缺損區(qū)。4、8周后取出缺損區(qū)標(biāo)本，測(cè)量骨體積分?jǐn)?shù)，含5 μmol/L芹菜素培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉組形成的新骨較其他對(duì)照組更多。本實(shí)驗(yàn)選擇Bio-oss骨粉復(fù)合細(xì)胞，是希望骨粉能在新骨形成過(guò)程中起到支架的作用，為成骨過(guò)程提供空間結(jié)構(gòu)，能更好的促進(jìn)成骨。

綜上所述，芹菜素能促進(jìn)hDPSCs的增殖和成骨向分化，5 μmol/L芹菜素培養(yǎng)的hDPSCs復(fù)合骨粉能促進(jìn)新西蘭兔顱骨缺損的修復(fù)。但分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，本研究可以為后續(xù)治療牙周骨缺損等疾病及制備原位液晶緩釋遞藥系統(tǒng)提供思路。