自噬對PC9/GR細(xì)胞吉非替尼敏感性及PD-L1影響的體外研究

李 軒，程 浩，方 樂，郝吉慶

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥常見的死亡原因之一，非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung carcinoma,NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%，且表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變占NSCLC患者50%～60%，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，預(yù)后較差。目前靶向治療和放化療是晚期NSCLC患者的主要治療手段。然而隨著用藥時間的延長，大多數(shù)接受酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinase inhibitor，TKIS)治療的患者不可避免地會產(chǎn)生獲得性耐藥，但其耐藥機(jī)制及如何有效治療靶向藥物耐藥后肺癌也成為國內(nèi)外研究的熱點。導(dǎo)致EGFR-TKIs耐藥的機(jī)制是多種多樣的，目前尚不十分清楚。研究表明自噬可在肺癌細(xì)胞中被EGFR-TKI激活，高水平自噬可能與EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥相關(guān)。程序性死亡因子配體-1(programmed death ligand 1,PD-L1)是經(jīng)典的免疫逃逸分子，相關(guān)研究表明PD-L1在吉非替尼繼發(fā)性耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高，但其是否參與繼發(fā)性耐藥尚不明確。該研究觀察調(diào)節(jié)自噬對PC9/GR耐藥細(xì)胞株藥物敏感性及對PD-L1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

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細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌吉非替尼敏感細(xì)胞株P(guān)C9(EGFR19外顯子缺失突變)和人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的高糖DMEM,置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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主要試劑和儀器 DMEM(高糖)購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；CCK-8試劑盒購自美國Apexbio公司；RT-qPCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；LC3B、PD-L1、p62、Beclin1(一抗)購自美國CST公司；山羊抗兔多抗、山羊抗鼠多抗(二抗)購自北京中杉金橋公司;吉非替尼購自大連美侖生物科技有限公司,按照說明書配置儲存濃度為10 mmol/L的溶液,分裝后放于-20 ℃冰箱中；氯喹二磷酸鹽(chloroquine，CQ)、雷帕霉素(rapamycin，Rap)購自北京索萊寶公司，CQ按說明書配制成儲存濃度為100 mmol/L的溶液,Rap分裝后按說明書配制成儲存濃度為400 μmol/L的溶液，放于-20 ℃冰箱中備用；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)購自美國MCE公司，分裝后按說明書配制成儲存濃度為20 mmol/L的溶液，放于-20 ℃冰箱中備用。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國SHELDON公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀購自美國SHELDON公司。

1.2 方法

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RT-qPCR檢測自噬水平 應(yīng)用RT-qPCR法測定PC9組、PC9/GR組細(xì)胞中PD-L1、Beclin1表達(dá)情況。用TRIzol提取細(xì)胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得產(chǎn)物cDNA,采用SYBR Green熒光定量試劑盒測定PD-L1和Beclin1表達(dá)情況,應(yīng)用RT-qPCR法測定PC9/GR組、2.5 mmol/L 3-MA處理PC9/GR組、5 mmol/L 3-MA處理PC9/GR組、10 mmol/L 3-MA處理PC9/GR組、50 μmol/L CQ處理PC9/GR組、100 nmol/L Rap處理PC9/GR組細(xì)胞PD-L1表達(dá)，以GAPDH為管家基因,由公式Folds=2計算檢測基因的相對表達(dá)強(qiáng)度。

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Western blot檢測自噬及PD-L1水平 利用Western blot檢測PC9組、PC9/GR組、2.5 mmol/L 3-MA處理PC9/GR組、5 mmol/L 3-MA處理PC9/GR組、10 mmol/L 3-MA處理PC9/GR組、50 μmol/L CQ處理PC9/GR組、100 nmol/L Rap處理PC9/GR組細(xì)胞中Beclin1(p62)、PD-L1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)情況。加入細(xì)胞裂解液RIPA/PMSF(100 ∶1)將細(xì)胞重懸,置冰上搖晃裂解30 min,4 ℃、14 000 r/min離心30 min,取上清液,BCA法測定總蛋白濃度,在SDS-PAGE凝膠中電泳,轉(zhuǎn)膜、封閉,切膜，GAPDH、PD-L1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜,將PVDF膜置于含兔抗或鼠抗IgG(1 ∶10 000)二抗的5%脫脂牛奶中，室溫?fù)u晃孵育1 h,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影,以GAPDH為內(nèi)參。

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CCK-8實驗測定細(xì)胞增殖 收集PC9、PC9/GR細(xì)胞，各組細(xì)胞稀釋為8×10/ml細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,每孔100 μl,培養(yǎng)24 h后,將含不同濃度的吉非替尼培養(yǎng)基加入PC9及PC9/GR細(xì)胞孔中,吉非替尼藥物濃度梯度設(shè)定:0、0.04、0.2、1、5、25、50、100 μmol/L；收集PC9/GR細(xì)胞、1 μmol/L吉非替尼處理PC9/GR組、5 mmol/L 3-MA處理PC9/GR組、50 μmol/L CQ處理PC9/GR組、5 mmol/L 3-MA+1 μmol/L吉非替尼處理PC9/GR組、50 μmol/L CQ+1 μmol/L吉非替尼處理PC9/GR組，培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl含10%CCK-8溶液,孵育2 h后,酶標(biāo)儀上450 nm處測吸光度(optical density,OD)值。細(xì)胞活力值(%)=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%,并計算各組的IC50值。每組濃度設(shè)5個復(fù)孔,獨立重復(fù)實驗3次。

2 結(jié)果

2.1 自噬在細(xì)胞株P(guān)C9和PC9/GR細(xì)胞中表達(dá)

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示:PC9/GR組細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Beclin1表達(dá)水平略高于PC9組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)。Western blot檢測結(jié)果顯示：PC9/GR組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1與PC9組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于PC9組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

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<0.000 1)(圖1B、1C)。

圖1 RT-qPCR和Western blot檢測PC9及PC9/GR基礎(chǔ)自噬水平A:PC9組與PC9/GR組細(xì)胞中Beclin1 mRNA的表達(dá);B:PC9組與PC9/GR組細(xì)胞中Beclin1 及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá);C:B圖中蛋白灰度值統(tǒng)計;與PC9組比較:****P<0.000 1

2.2 不同方式處理后耐藥細(xì)胞PC9/GR增殖活性

CCK-8實驗結(jié)果顯示:吉非替尼對PC9組、PC9/GR組細(xì)胞增殖的抑制作用均隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。PC9/GR組細(xì)胞的吉非替尼IC50高于PC9組細(xì)胞的吉非替尼IC50，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)(圖2A、2B)。此外，加入2種不同的自噬抑制劑后，PC9/GR細(xì)胞增殖受到抑制，較吉非替尼單藥(1 μmol/L)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

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<0.05)，且3-MA抑制作用更明顯，故選擇3-MA進(jìn)行后續(xù)實驗(圖2C、2D)。

圖2 CCK-8實驗測定不同方式處理后細(xì)胞增殖活性A:CCK-8實驗檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞的細(xì)胞活力;B: PC9及PC9/GR細(xì)胞的IC50值;C:利用3-MA抑制自噬對吉非替尼耐藥的逆轉(zhuǎn)作用；a組：PC9/GR對照組；b組：3-MA單藥組；c組：吉非替尼單藥組；d組：3-MA+吉非替尼組；D:利用CQ抑制自噬對吉非替尼耐藥的逆轉(zhuǎn)作用；a組：PC9/GR對照組；e組：CQ單藥組；c組：吉非替尼單藥組；f組：CQ+吉非替尼組；與PC9/GR組比較:####P<0.000 1;與c組比較：***P<0.001，****P<0.000 1

2.3 PD-L1在細(xì)胞株P(guān)C9 和 PC9/GR細(xì)胞中表

達(dá)及抑制PC9/GR自噬后PD-L1變化

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:PC9/GR組細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平高于PC9組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05),見圖3A。Western blot檢測結(jié)果顯示：PC9/GR組細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)與PC9組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，見圖3B、3C。3-MA抑制PC9/GR自噬后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ下降，p62升高，PD-L1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，見圖3E、3F，且qPCR結(jié)果與Western blot結(jié)果相一致。

圖3 PD-L1在細(xì)胞株P(guān)C9 和 PC9 /GR細(xì)胞中表達(dá)及抑制PC9/GR自噬后PD-L1變化A:PC9組與PC9/GR組細(xì)胞中Beclin1 mRNA的表達(dá);B:PC9組與PC9/GR組細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá);C: B圖中蛋白灰度值統(tǒng)計; D: PC9/GR組與5 mmol/L 3-MA 處理24 h后PC9/GR組細(xì)胞中PD-L1 mRNA的表達(dá)；E：PC9/GR組與5 mmol/L 3-MA 處理24 h后PC9/GR組細(xì)胞中PD-L1及p62、LC3II/LC3I蛋白表達(dá);F:E圖中蛋白灰度值統(tǒng)計；與PC9組比較：***P<0.001；與PC9/GR組比較：#P<0.05，###P<0.001，####P<0.000 1

2.4 不同濃度不同時間3-MA處理PC9/GR后PD-L1表達(dá)情況

Western blot檢測結(jié)果顯示：2.5、5、10 mmol/L 3-MA組PD-L1表達(dá)較對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；2.5 mmol/L 3-MA p62表達(dá)較對照組上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)，5、10 mmol/L 3-MA組p62表達(dá)較對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；2.5、5、10 mmol/L 3-MA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)較對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。不同時間3-MA處理PC9/GR結(jié)果顯示：4、8、24、48 h 3-MA處理后的PC9/GR PD-L1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ較對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)； 8、24、48 h處理后的細(xì)胞P62蛋白較對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，且24 h p62蛋白變化最明顯；qPCR結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，見圖4。

圖4 不同濃度不同時間3-MA處理PC9/GR后PD-L1表達(dá)情況A:不同時間3-MA處理PC9/GR后PD-L1及p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)情況；B:A圖灰度值統(tǒng)計；C: 不同時間3-MA處理PC9/GR后PD-L1 mRNA表達(dá)情況；D: 不同濃度3-MA處理PC9/GR后PD-L1及p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)情況；E: D圖灰度值統(tǒng)計；F: 不同濃度3-MA處理PC9/GR后PD-L1 mRNA表達(dá)情況;a：PC9/GR對照組；b: 2.5 mmol/L 3-MA處理PC9/GR細(xì)胞組；c: 5 mmol/L 3-MA處理PC9/GR細(xì)胞組；d: 10 mmol/L 3-MA處理PC9/GR細(xì)胞組；與Con組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1；與PC9/GR對照組比較：###P<0.001

2.5 CQ、Rap、3-MA處理后PC9/GR自噬水平和PD-L1水平

Western blot檢測結(jié)果顯示：3-MA及CQ處理的PC9/GR的PD-L1較對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。Rap處理后的PC9/GR的PD-L1較對照組上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。3-MA處理后的PC9/GR的LC3II蛋白表達(dá)較對照組下降，p62較對照組上升，自噬流通暢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.001)。Rap處理后的PC9/GR的LC3Ⅱ蛋白表達(dá)較對照組上升，p62較對照組下降，自噬流通暢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

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<0.05)。CQ處理后的PC9/GR的LC3II蛋白表達(dá)較對照組上升，但p62較對照組也上升，自噬流不通暢，自噬被抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；qPCR結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，見圖5。

圖5 不同藥物處理后PC9/GR自噬水平和PD-L1水平A: 不同藥物處理PC9/GR后PD-L1及p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)情況；B：各蛋白灰度值統(tǒng)計；C：不同藥物處理PC9/GR后PD-L1 mRNA表達(dá)情況；與Con組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

自噬是一種自我消化的細(xì)胞過程，通過形成雙膜囊泡(自噬體)將細(xì)胞從細(xì)胞質(zhì)中分離出來，這種雙膜囊泡可在短時間內(nèi)降解包括細(xì)胞器和蛋白質(zhì)在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)容物，從而使細(xì)胞可以在惡劣的條件下(例如壓力、缺氧和饑餓)生存。目前，自噬在腫瘤的治療中起著雙重作用，可以增加或降低治療效果，但是，大多數(shù)研究認(rèn)為自噬可以介導(dǎo)某些腫瘤的耐藥性。誘導(dǎo)自噬可以促進(jìn)抗癌藥的耐藥性，抑制自噬可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤治療的耐藥性。本研究顯示，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR中上調(diào)；Beclin1作為自噬形成的主要因子之一,與自噬相互促進(jìn)，其無明顯變化考慮可能與PC9/GR為PC9敏感株繼發(fā)耐藥細(xì)胞有關(guān)。CCK-8結(jié)果顯示，PC9/GR細(xì)胞對吉非替尼藥物敏感性低于PC9；作為影響自噬過程中兩種不同類型的自噬抑制劑，3-MA影響自噬的形成過程，CQ影響自噬溶酶體的降解，3-MA和CQ對細(xì)胞増殖的影響不同，但二者均可部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對吉非替尼的耐藥，且3-MA抑制作用更明顯。因此，體外靶向自噬可能部分逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI治療的耐藥性。

PD-L1屬于重要的免疫檢查點。PD-L1與程序性死亡受體-1(PD-1)結(jié)合，PD-L1/PD-1通路下調(diào)免疫應(yīng)答效應(yīng)T細(xì)胞，從而引起免疫抑制。已有研究顯示PD-L1高表達(dá)與原發(fā)性EGFR-TKIs耐藥有關(guān)，但對繼發(fā)性耐藥尚沒有明確報道。目前考慮繼發(fā)性耐藥中PD-L1高表達(dá)涉及的可能更是一種適應(yīng)性免疫抵抗。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)是目前使用最常見的自噬體標(biāo)志物，LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化可被認(rèn)為是自噬發(fā)生的重要標(biāo)志；p62是第一個被發(fā)現(xiàn)的選擇性自噬受體，其降解是另一個廣泛用于監(jiān)測自噬活性的標(biāo)志物，p62直接與LC3II結(jié)合，并被自噬選擇性降解；LC3II與p62變化方向相反時，自噬流通暢，但變化方向一致時，自噬流不通暢，代表自噬抑制，故自噬的檢測需結(jié)合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62的結(jié)果來觀察。 本研究顯示，PD-L1在吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR中表達(dá)上調(diào)，用3-MA抑制自噬后，LC3II/LC3I下降，p62上升，自噬流通暢，自噬水平下降，PD-L1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不同濃度3-MA處理PC9/GR時，5 mmol/L 3-MA LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62變化最明顯，PD-L1隨自噬水平的改變而變化； 5 mmol/L 3-MA處理PC9/GR不同時間時，24 h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62變化最明顯，PD-L1隨自噬水平的改變而變化。當(dāng)用氯喹處理PC9/GR時，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上升，但p62也上升，自噬流不通暢，代表自噬被抑制，PD-L1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)用Rap處理PC9/GR時，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上升，p62下降，自噬被誘導(dǎo)，PD-L1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步說明，當(dāng)不同藥物上調(diào)或下調(diào)自噬時，PD-L1也會隨之增加或減少。

綜上所述，體外實驗結(jié)果提示在吉非替尼耐藥細(xì)胞中抑制自噬可部分逆轉(zhuǎn)PC9/GR吉非替尼耐藥性，提示PD-L1可能受自噬調(diào)控，且隨自噬水平的變化而改變，PD-L1可能參與體外抑制自噬逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的過程。但PD-L1如何參與體外抑制自噬逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。