Er,Cr:YSGG激光清除SLA鈦表面牙齦卟啉單胞菌生物膜

余金蘭，夏 榮，劉 春，徐基亮，孫 磊

種植體周圍炎是一種發(fā)生在種植體周圍的炎癥性疾病，表現(xiàn)為種植體周圍軟組織炎癥和骨喪失，是種植失敗的常見原因之一，發(fā)病率約為22%。研究表明，慢性牙周炎病史、吸煙等雖可以增加種植體周圍炎的發(fā)病風(fēng)險，但與牙周病類似，菌斑生物膜依舊是其始動因子。因此，治療種植體周圍炎的首要目標(biāo)是徹底有效地清除種植體表面污染，暴露微結(jié)構(gòu)。近些年，激光已被用于治療種植體周圍炎，它們能消融種植體表面的菌斑、牙石，還可以清除細(xì)菌毒素、脂多糖；局部使用不會引起全身反應(yīng)；減少術(shù)中出血、疼痛和術(shù)后腫脹。但激光的治療效果受功率、頻率等多種因素影響。該研究旨在探究應(yīng)用不同功率Er,Cr:YSGG激光清除噴砂酸蝕(sandblasted, large-grit, acid-etched, SLA)鈦表面牙齦卟啉單胞菌生物膜的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑

Er,Cr:YSGG水激光口腔治療儀(美國Biolase公司)；商業(yè)純鈦(TA1)(東莞冠躍金屬材料有限公司)；GeminiSEM500掃描電子顯微鏡、LSM880激光掃描共聚焦顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司)；麥?zhǔn)媳葷醿x(上海梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司)；Invitrogen L-7012 活/死菌細(xì)菌活力試劑盒、多功能微孔板酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技公司)；牙齦卟啉單胞菌(北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司)；人工唾液、腦心浸液培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)(上海索萊寶生物科技有限公司)；結(jié)晶紫溶液、抗熒光淬滅劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；維生素 K1 注射液(上海信然原裝生物試劑)。

1.2 試件制備

純鈦試件(直徑10 mm×1 mm)經(jīng)75%乙醇溶液清洗后進(jìn)行SLA處理。AlO砂粒(120 μm)在0.45 MPa氣壓下垂直噴射轟擊試件30 s，距離為5 cm。隨后浸入18%鹽酸和48%硫酸以1 ∶1(

v/v

)的混合酸溶液中，60 ℃水浴加熱30 min，雙蒸水超聲振蕩15 min。制備成功的 SLA鈦試件儲存于0.9%氯化鈉溶液中，使用前環(huán)氧乙烷消毒滅菌。

1.3 牙齦卟啉單胞菌生物膜制備

凍存的牙齦卟啉單胞菌菌株于BHI血瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇，37 ℃厭氧環(huán)境(80% N、10% CO、10% H)培養(yǎng)72 h。挑取血瓊脂培養(yǎng)基上單菌落于BHI血清培養(yǎng)基中制備成6×10CFU/ml的菌懸液。將試件置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，受試面朝上，加入500 μl 0.22 μm濾膜過濾后的人工唾液，靜置過夜以形成人工獲得性膜。獲得性膜形成后各孔內(nèi)分別加入1 ml上述菌懸液，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。

1.4 激光處理與分組

Er,Cr:YSGG激光處理：采用Er,Cr:YSGG激光器(波長2 780 nm，功率0.75 W或1.5 W，頻率30 Hz，脈沖時間140 μs，空氣壓力40%，水壓力40%)，選用MZ6工作尖(直徑600 μm)，離試件表面2 mm，垂直于試件表面照射，單次照射時間30 s。采用系統(tǒng)抽樣將所有試件隨機(jī)分為3組，每組11枚。NL組：不做任何處理；L1組：0.75 W的Er,Cr:YSGG激光處理；L2組：1.5 W的Er,Cr:YSGG激光處理。

1.5 掃描電子顯微鏡觀察

每組隨機(jī)抽取3枚試件，PBS沖洗去除試件表面黏附不牢的細(xì)菌。2.5%戊二醛固定1 h，PBS清洗后，50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液梯度脫水，干燥，噴金，掃描電子顯微鏡下觀察各組SLA試件表面牙齦卟啉單胞菌生物膜情況。

1.6 活/死細(xì)菌染色

利用L-7012 活/死菌細(xì)菌活力試劑盒鑒別SLA試件表面活/死細(xì)菌。將SYTO9、PI、蒸餾水按1.5 μl ∶1.5 μl ∶1 ml 的比例配制成熒光染液，避光備用。每組隨機(jī)抽取3枚試件，PBS沖洗去除試件表面黏附松散的細(xì)菌，吸取200 μl上述熒光染液滴于試件表面，于室溫、黑暗條件下孵育15 min，PBS輕洗。黑暗環(huán)境中，在試件表面滴一滴抗熒光淬滅劑, 4 ℃避光存放并立即鏡檢。將試件倒置在載波片上，激光掃描共聚焦顯微鏡(×40)下觀察。

1.7 結(jié)晶紫染色法檢測試件表面的細(xì)菌數(shù)量

激光處理后，各組隨機(jī)選取5枚試件。2.5%戊二醛固定30 min，棄去固定液，PBS輕洗，烘箱37 ℃干燥，加入1 ml 1%結(jié)晶紫溶液，振搖20 min，然后用PBS將游離染料徹底清洗干凈，加入1 ml 33%醋酸溶液，充分震蕩，酶標(biāo)儀測量波長590 nm處的吸光度(optical density，OD)值。

2 結(jié)果

2.1 掃描電子顯微鏡觀察

干凈SLA鈦表面形態(tài)不規(guī)則，可見大小不一的微米級凹陷，邊緣較銳利(圖1A)。各組試件表面牙齦卟啉單胞菌生物膜的掃描電子顯微鏡圖如圖1B～1D。NL組：獲得性膜形成，覆蓋粗糙表面，其上大量細(xì)菌定植繁衍；L1組：牙齦卟啉單胞菌生物膜表層被清除，試件表面仍覆蓋大量獲得性膜和少量細(xì)菌；L2組：試件表面結(jié)構(gòu)暴露，暴露區(qū)域的形態(tài)結(jié)構(gòu)與干凈SLA鈦表面無區(qū)別，未觀察到熔化、融合等結(jié)構(gòu)改變。

圖1 試件表面牙齦卟啉單胞菌生物膜的掃描電子顯微鏡圖 ×2 500A：干凈SLA鈦表面；B：NL組；C：L1組；D：L2組

2.2 活/死細(xì)菌染色結(jié)果

NL組：試件表面含有大量的綠色熒光(活菌)和部分紅色熒光(死菌)，經(jīng)激光處理后，熒光成分明顯減少；L1組：少量綠色熒光(活菌)散在分布；L2組：可見零星綠色熒光(活菌)。見圖2。

圖2 試件表面活/死細(xì)菌染色的激光掃描共聚焦顯微鏡圖 ×40A：NL組；B：L1組；C：L2組；紅色：死菌；綠色：活菌

2.3 試件表面的細(xì)菌數(shù)量

采用單因素方差分析比較3組之間的差異，NL組OD值最大，而經(jīng)激光處理后，L1組、L2組OD值減少，與NL組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=2 588.12，

P

<0.001)。雖然L2組的OD值小于L1組，但兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖3 結(jié)晶紫染色法檢測各組試件表面的細(xì)菌數(shù)量與NL組比較：***P<0.001

3 討論

種植體周圍炎作為常見的種植并發(fā)癥之一，可以引起種植體周圍組織炎癥，骨組織吸收，進(jìn)而引起種植體松動、脫落。近年來，激光應(yīng)用于種植體周圍炎的治療，它們可以殺滅種植體表面存在的微生物，消融菌斑、牙石，還可以粗化種植體表面以便于再次發(fā)生骨結(jié)合。Er,Cr:YSGG激光的吸收系數(shù)與水及羥基磷灰石的吸收峰值相匹配，可釋放波長2 780 nm的高速動能水分子以完成組織的切割及消融。在種植體周圍炎的治療過程中，菌斑、牙石中的羥基磷灰石和水被吸收，從而完成種植體表面去污；而當(dāng)其作用于軟組織時，能達(dá)到很好的切割和止血效果，降低水腫的發(fā)生，避免切割后創(chuàng)面結(jié)痂，降低感染的可能性，同時還可以加快組織愈合。

Ercan et al用掃描電子顯微鏡定性評估經(jīng)不同參數(shù)Er,Cr:YSGG激光照射后不同種植體表面的形貌變化，發(fā)現(xiàn)不同參數(shù)會不同程度地影響種植體表面，而不同種植體表面經(jīng)同一參數(shù)激光照射后影響程度亦不相同，說明頻率、功率、照射時間、照射距離以及種植體表面類型等都會影響激光對種植體的作用。因此，在治療過程中頻率、功率、照射時間、照射距離以及種植體表面類型等參數(shù)都應(yīng)慎重考慮。有研究表明當(dāng)Er,Cr:YSGG激光的能量密度小于等于50 mJ/pulse(20 Hz)，SLA微結(jié)構(gòu)表面未觀察到改變；但能量密度為60 mJ/pulse時，可觀察到顏色變化。該實(shí)驗(yàn)所使用的激光參數(shù)(0.75 W或1.5 W)亦未在試件表面造成融化、融合等結(jié)構(gòu)改變。

實(shí)驗(yàn)利用活/死細(xì)菌染色和結(jié)晶紫染色法檢測各組表面細(xì)菌情況，兩者具有相同趨勢：經(jīng)0.75 W或1.5W的Er,Cr:YSGG激光處理后，活/死細(xì)菌染色后在激光掃描共聚焦顯微鏡下幾乎看不到細(xì)菌的存在，結(jié)晶紫染色法的結(jié)果顯示0.75 W或1.5 W的Er,Cr:YSGG激光組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。然而在掃描電子顯微鏡下，0.75 W的Er,Cr:YSGG激光組試件表面仍有大量獲得性膜覆蓋，遮擋其原有形貌，1.5 W的Er,Cr:YSGG激光組試件表面幾乎觀察不到生物膜的存在。這種結(jié)果的產(chǎn)生可能是由于實(shí)驗(yàn)制備的牙齦卟啉單胞菌生物膜，細(xì)菌黏附定植于獲得性膜表面，激光處理時，激光束和水/氣首先作用于細(xì)菌，因此在試件表面幾乎觀察不到細(xì)菌的存在，而0.75 W的Er,Cr:YSGG激光組由于設(shè)置的功率較小或作用時間較短，不能完全清除試件表面上的獲得性膜。Schwarz et al的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Er,Cr:YSGG激光具有功率、時間依賴的清除菌斑生物膜的能力，隨著設(shè)置功率的增加，殘余菌斑面積顯著減小，但當(dāng)激光功率設(shè)為2 W或2.5 W時，會影響表層化學(xué)組成，從而降低表面細(xì)胞活力。Strever et al的研究表明1.0～1.5 W Er,Cr:YSGG激光可以清除種植體表面95%以上的牙齦卟啉單胞菌并且不破壞其表面結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示1.5 W的Er,Cr:YSGG激光可以有效清除SLA鈦表面牙齦卟啉單胞菌生物膜。

然而本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，所制備的牙齦卟啉單胞菌生物膜并不能完全模擬種植體周圍炎時種植體表面的情況。由于獨(dú)特的能量分布和激光傳輸系統(tǒng)的固有差異，不同制造商生產(chǎn)的Er,Cr:YSGG激光設(shè)備的最佳能量輸出會有所不同。臨床使用過程中應(yīng)更好地了解不同激光設(shè)備的特性差異，使用最佳激光參數(shù)安全有效地進(jìn)行種植體周圍炎的治療。