氯氮平對(duì)雄性C57BL/6小鼠淀粉酶和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

趙彤彤 ，寧曉帥，楊亞婷，張雨龍，任振華，劉寰忠

精神分裂癥是一種常見的、嚴(yán)重危害人類健康的精神疾病，其中難治性精神分裂癥至少占到20%，氯氮平是治療難治性精神分裂癥的首選藥物。但其臨床應(yīng)用受到嚴(yán)重不良反應(yīng)的限制，其中就包括胰腺炎。關(guān)于氯氮平導(dǎo)致胰腺損傷的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究顯示促炎性細(xì)胞因子在胰腺炎的病程進(jìn)展中起到重要作用，而血淀粉酶是臨床胰腺炎診斷的首選實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目。該研究旨在探討氯氮平對(duì)小鼠血液以及胰腺組織中淀粉酶和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以期有助于初步探索氯氮平導(dǎo)致胰腺損傷的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK(皖)2017-001]，體質(zhì)量(20±2)g。分籠飼養(yǎng)于明暗周期為12 h晝夜節(jié)律，相對(duì)濕度45%左右，室溫(22±2)℃的普通設(shè)施中，普通全價(jià)鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：LLSC20190743)。

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藥品與試劑 氯氮平(上海上藥信誼藥廠有限公司, 批號(hào): H31021152)；水合氯醛(上海生工生物工程有限公司)。RIPA裂解液和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；ECL超敏發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；鼠一抗α-tubulin抗體(T6199)購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；兔一抗淀粉酶(amylase)(貨號(hào)：ab21156)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β(貨號(hào)：ab9722)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)(貨號(hào)：ab6671)抗體購自英國(guó)Abcam公司；兔一抗IL-6抗體(12912S)購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。TRIzol試劑盒(美國(guó)Life Technogies公司)；DEPC-HO(上海捷瑞生物工程有限公司)；RevertAid第一鏈 cDNA Synthesis試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒(上海近岸蛋白科技有限公司)；其他試劑為分析純。

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主要儀器 電子天平(上海菁海儀器有限公司)；pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；多功能酶標(biāo)儀、高速低溫離心機(jī)、熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

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模型的制作和標(biāo)本的處理 48只雄性C57BL/6小鼠按照隨機(jī)化原則分為四組，分別為對(duì)照組、氯氮平(5、10、20 mg/kg)組。氯氮平充分研磨后加入0.9%氯化鈉溶液，分別配成濃度為0.5、1、2 mg/ml的懸濁液，每次灌胃前充分搖勻。每日在給藥前先稱重每只小鼠的體質(zhì)量，氯氮平5 mg/kg組的小鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃0.5 mg/ml的懸濁液，氯氮平10 mg/kg組的小鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃1 mg/ml的懸濁液，氯氮平20 mg/kg組的小鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃2 mg/ml的懸濁液，對(duì)照組小鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃相應(yīng)體積0.9%氯化鈉溶液。上述各組小鼠每日上午9:00灌胃1次，連續(xù)14 d給予相應(yīng)劑量藥物。期間各組小鼠飲食自由。末次給藥前禁食不禁水12 h，給藥后再禁食3 h，隨后腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠的麻醉狀態(tài)達(dá)到最佳時(shí)，剖腹打開小鼠胸腔后完全暴露心臟，然后經(jīng)心臟穿刺采血置于惰性分離膠促凝管內(nèi)，低溫離心后分離血清置-80 ℃ 冰箱中待測(cè)；采血后立即取出小鼠胰腺組織液氮驟冷，置于-80 ℃冰箱保存待用。每組小鼠中的6個(gè)胰腺組織用于Western blot實(shí)驗(yàn)，另外6個(gè)胰腺組織用于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

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小鼠血清amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的測(cè)定 血清amylase采用比色分析試劑盒(ab102523)測(cè)定，血清IL-1β、IL-6、TNF-α采用ELISA試劑盒(ab197742、ab222503、ab46105)測(cè)定。上述試劑盒均購自英國(guó)Abcam公司，嚴(yán)格按照制造商的說明書操作。

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Western blot測(cè)定小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá) 從每組小鼠各取6個(gè)胰腺組織，每個(gè)胰腺組織加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液后冰上勻漿提取蛋白，在冷凍離心機(jī)中以12 000 r /min離心15 min，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度計(jì)算每個(gè)樣本的上樣量，蛋白樣品與上樣緩沖液體積比4 ∶1混合, 總體積不超過20 μl，用10%SDS-PAGE分離蛋白, 電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后用4%BSA室溫封閉2 h。再將膜溶于含4%BSA中的一抗4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。洗膜后將膜浸入用二抗稀釋液稀釋的二抗中, 室溫下孵育2 h。參考ECL發(fā)光試劑盒說明書，使用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行底物顯影曝光拍照，采用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值，所有蛋白條帶灰度值均以對(duì)應(yīng)的a-tubulin為基準(zhǔn)進(jìn)行校正, 計(jì)算相對(duì)灰度值。

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熒光定量PCR測(cè)定小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá) 從每組小鼠各取6個(gè)胰腺組織，剪碎，液氮研磨后，加入TRIzol核酸提取液裂解，冰上勻漿, 按操作說明提取總RNA。室溫干燥RNA沉淀，加入DEPC水, -80 ℃保存?zhèn)溆谩０茨孓D(zhuǎn)錄試劑盒說明書在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制成cDNA。RT反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。取出所得的cDNA作為熒光定量的模板，構(gòu)建反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性1 min, 95 ℃變性20 s, 60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。讀取目的基因amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α及對(duì)應(yīng)內(nèi)參基因β-actin的閾值循環(huán)數(shù)(Ct值), 再采用比較ΔCt值的相對(duì)定量法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。PCR引物序列均由上海生工生物工程公司合成(表1)。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 氯氮平對(duì)小鼠外周血amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

如表2所示，氯氮平給藥后小鼠血清amylase水平升高(

F

=7.890,

df

=3,

P

<0.001)；與對(duì)照組相比，氯氮平10 mg/kg和20 mg/kg 組血清amylase水平明顯升高(

P

<0.01,

P

<0.001)。氯氮平給藥后小鼠血清IL-1β水平升高(

F

=6.976,

df

=3,

P

<0.01)；與對(duì)照組相比，氯氮平5 mg/kg和10 mg/kg組血清IL-1β水平明顯升高(

P

<0.01)；氯氮平20 mg/kg組與對(duì)照組相比升高更加明顯(

P

<0.001)。氯氮平給藥后也影響了小鼠血清IL-6的水平(

F

=4.033,

df

=3,

P

<0.05)；與對(duì)照組相比，氯氮平5 mg/kg組的IL-6水平有所下降(

P

<0.05)。氯氮平給藥后對(duì)小鼠血清TNF-α水平無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=0.272,

df

=3,

P

>0.05)。

表2 四組小鼠血清amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比較

2.2 氯氮平對(duì)小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

如圖1、表3所示，氯氮平能上調(diào)小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平(

F

=95.042,

df

=3,

P

<0.001；

F

=184.349,

df

=3,

P

<0.001；

F

=332.945,

df

=3,

P

<0.001；

F

=219.696,

df

=3,

P

<0.001)。與對(duì)照組相比，氯氮平5、10、20 mg/kg組的胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平明顯升高(

P

<0.01)。氯氮平給藥后小鼠胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平與它們各自的蛋白表達(dá)水平基本一致(

F

=121.605,

df

=3,

P

<0.001；

F

=125.620,

df

=3,

P

<0.001；

F

=70.350,

df

=3,

P

<0.001；

F

=74.281,

df

=3,

P

<0.001)，與對(duì)照組相比，氯氮平5、10和20 mg/kg組的胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯升高(

P

<0.01)。見表4。

圖1 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的相對(duì)表達(dá)量1:對(duì)照組；2:氯氮平5 mg/kg組；3:氯氮平10 mg/kg組；4:氯氮平20 mg/kg組

表3 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平的比較

表4 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

近年來隨著非典型抗精神病藥物的廣泛使用，由抗精神病藥引起的藥物性胰腺炎逐漸引起關(guān)注，據(jù)美國(guó)FDA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明抗精神病藥中導(dǎo)致胰腺炎報(bào)道最多的藥物是氯氮平。氯氮平的用藥起始時(shí)間與胰腺炎的發(fā)病進(jìn)一步支持了因果關(guān)系，所有患者均表現(xiàn)為血清amylase水平的升高。有研究顯示患者在氯氮平治療初期即會(huì)引起免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為外周血細(xì)胞因子的升高。在這期間內(nèi)，患者被懷疑具有藥物相關(guān)副作用的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到最高。值得注意的是，對(duì)于氯氮平一些其他潛在危及生命的副作用已經(jīng)提出了免疫介導(dǎo)機(jī)制。氯氮平治療后對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用并可能伴隨著炎癥副作用的發(fā)生，提示免疫機(jī)制可能參與氯氮平副作用的發(fā)生。

血amylase是臨床胰腺炎診斷的首選實(shí)驗(yàn)室檢查，本研究結(jié)果顯示，氯氮平可導(dǎo)致小鼠血清amylase呈劑量依賴性升高。目前關(guān)于非典型抗精神病藥對(duì)血amylase影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)較少，國(guó)外僅有1項(xiàng)奧氮平口服給藥的大鼠實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示奧氮平導(dǎo)致大鼠血清amylase明顯升高。奧氮平的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用與氯氮平類似，是抗精神病藥物中報(bào)告胰腺炎發(fā)生率僅次于氯氮平的藥物。國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)對(duì)氯氮平急性中毒患者的研究顯示，一次性大劑量服用氯氮平導(dǎo)致患者的血amylase明顯升高乃至出現(xiàn)高淀粉酶血癥，這進(jìn)一步提供了藥物本身致病作用的證據(jù)并支持了亞臨床性胰腺炎的可能。

胰腺炎作為一種炎癥性疾病，活化的巨噬細(xì)胞先誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生損傷并產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的，其中TNF-α和IL-1β是一階段促炎性因子，它們通過再激活巨噬細(xì)胞并調(diào)節(jié)其他炎癥介質(zhì)如IL-6的釋放來增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，因此促炎性細(xì)胞因子的檢測(cè)為評(píng)估胰腺損傷的嚴(yán)重程度提供了客觀依據(jù)。該研究結(jié)果顯示氯氮平不僅使小鼠胰腺組織中amylase的表達(dá)顯著升高，而且小鼠胰腺組織中促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平也呈劑量依賴性地升高。這些結(jié)果與經(jīng)典酒精性胰腺炎小鼠模型中的結(jié)果一致，更加支持了胰腺組織中炎性介質(zhì)的逐漸積累直至胰腺炎癥的發(fā)生，從而表現(xiàn)為臨床上有癥狀的急性胰腺炎。

本研究表明氯氮平顯著升高了血清IL-1β的水平，這與胰腺組織中IL-1β的表達(dá)趨勢(shì)一致。IL-1β已被證實(shí)在胰腺炎病程進(jìn)展中起到核心作用，有研究表明通過使用IL-1β轉(zhuǎn)化酶抑制劑，可以改善急性重癥胰腺炎損傷的嚴(yán)重程度。但氯氮平對(duì)小鼠血清IL-6和TNF-α表達(dá)的影響卻與胰腺組織中的趨勢(shì)不一致，氯氮平在低劑量組使血清IL-6降低了，而氯氮平三組對(duì)血清TNF-α均無明顯影響。實(shí)際上，一直以來關(guān)于氯氮平對(duì)外周血細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用并沒有得出一致趨勢(shì)的結(jié)論，這有待進(jìn)一步的研究。