七葉皂苷鈉通過降低4EBP1的磷酸化水平抑制梗阻性黃疸大鼠小膽管增生

汪先凱，周大臣，喻宗繁，崔 笑

梗阻性黃疸是一種常見的臨床病癥，是機體膽汁流出道受阻，如膽管結(jié)石、腫瘤及炎癥增生等致使膽管變窄或完全阻塞，膽紅素代謝障礙并返流入血，造成鞏膜、黏膜黃染。梗阻性黃疸可誘導(dǎo)肝細胞壞死、膽管增生，并發(fā)嚴重的淤膽性肝纖維化甚至肝衰竭。世界范圍內(nèi)，梗阻性黃疸造成淤膽性肝纖維化呈逐年上升的趨勢。對于梗阻性黃疸繼發(fā)的膽性肝纖維化，解除膽道梗阻是最根本的治療措施。然而即使進行膽管引流治療，肝功能的恢復(fù)仍然面臨著一些困難。因此尋找一種方式去減輕患者梗阻性黃疸淤膽情況及加快患者肝纖維化恢復(fù)具有重要臨床意義。大鼠膽管結(jié)扎致使肝臟匯管區(qū)周圍小膽管大量增生以及淤膽性肝纖維化的形成，能較好地模擬臨床疾病梗阻性黃疸。七葉皂苷鈉(商品名:麥通鈉)是從七葉樹科植物天師栗的干燥成熟果實娑羅子中提取得到的天然三萜糖苷類化合物的鈉鹽。本課題組前期研究顯示七葉皂苷鈉對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有顯著的防治作用，且有研究表明七葉皂苷鈉對肝細胞膜有保護作用，可以改善急性肝損傷。該實驗對膽管結(jié)扎大鼠模型展開相關(guān)研究，探究七葉皂苷鈉對于梗阻性黃疸大鼠肝臟組織匯管區(qū)周圍小膽管的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

注射用七葉皂苷鈉(山東綠葉制藥有限公司)；伊紅染液(BL703A,合肥Biosharp公司)；蘇木精染色液(PH0516,福州飛凈生物科技有限公司)；兔抗磷酸化真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(phosphorylated eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1，p-4EBP1)單克隆抗體(236B4，#2855，美國CST公司)；兔抗真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)單克隆抗體(53H11,#9644,美國CST公司)；兔抗α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體(A11111，武漢愛博泰克生物科技有限公司)；兔抗Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，COL-Ⅰ)蛋白多克隆抗體(BA0325)、鼠抗Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ，COL-Ⅲ)蛋白單克隆抗體(BM1625)(武漢博士德生物工程有限公司)；DAB顯色試劑盒(K186916P，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔二步法熒光檢測試劑盒(PV-9001)、超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(PV9001)、小鼠二步法熒光試劑盒(PV-6002)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAPI染色液(C1006，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)；Masson三色染色液(固綠法，G1343)、牛血清白蛋白(blood serum albumins，BSA)(北京索萊寶科技有限公司)。

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主要儀器 蔡司Axioscope5正置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司)；分析天平(上海精天電子儀器有限公司)；高速低溫離心機(美國Eppendorf公司)；脫色搖床(北京六一生物科技有限公司)；CryoStar NX50型冷凍切片機(上海賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 實驗動物及處理方法

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量150～200 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號:SCXK(皖)2017-001。在室溫20～25 ℃、濕度40%～60%、12 h照明與12 h黑暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進食、飲水，將81只健康雄性SD大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進行膽管結(jié)扎手術(shù)。大鼠術(shù)前禁食8 h，禁水4 h。以水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉。剃去腹部毛發(fā)，以碘伏仔細消毒皮膚。從劍突到恥骨作腹部正中切口，解剖肝門部，尋找膽總管，4-0絲線雙重結(jié)扎膽總管。2-0帶針手術(shù)縫線縫合腹膜、肌層和皮膚。假手術(shù)組僅剖腹游離肝門部膽總管，不予結(jié)扎，2-0帶針手術(shù)縫線縫合腹膜、肌層和皮膚。手術(shù)后24 h，膽管結(jié)扎大鼠隨機分為3組:單純膽管結(jié)扎組(

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=36)、七葉皂苷鈉組(

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=27)、假手術(shù)組(

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=18)。七葉皂苷鈉組大鼠每日予以腹腔注射3.6 mg/kg七葉皂苷鈉溶液(溶于0.9%氯化鈉溶液配制為1 g/L溶液)1次,單純膽管結(jié)扎組和假手術(shù)組同期給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液，其余飼養(yǎng)條件相同。連續(xù)給藥7 d后處死實驗大鼠，下腔靜脈采血離心(3 000 r/min，15 min)，獲得血清樣本。取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝右葉組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.4)中,用于組織病理學(xué)研究。剩余肝臟樣本及制備好的血清樣本保存于-80 ℃ 的冰箱。

1.4 檢測方法及指標

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病理學(xué)觀察 肝組織標本于4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定，常規(guī)脫水，包埋，制備石蠟切片，厚度為5 μm。參照標準方法進行蘇木精-伊紅染色及Masson染色，二甲苯透明，中性樹脂封片，切片由不知道分組情況的研究員顯微鏡下讀片。

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肝組織免疫組化 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水洗?？乖迯?fù)：放入pH值為6.0枸櫞酸鈉緩沖液中(含0.05% Tween-20)，在高壓鍋中煮沸10 min，自來水慢速沖洗降溫20 min。3%過氧化氫-甲醇混合液孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物活性。TBST溶液(TBS+0.2% Triton-X,pH=7.6)室溫下浸泡組織切片10 min。山羊血清封閉內(nèi)源性生物素90 min，一抗(α-SMA、4EBP1、p-4EBP1 1 ∶100稀釋)4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，按照二抗試劑盒說明書操作滴加二抗。DAB顯色，顯微鏡下控制時間。蒸餾水洗，蘇木精復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，切片由不知道分組情況的研究員顯微鏡下讀片。

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肝組織免疫熒光 肝組織標本于4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定，30%蔗糖磷酸緩沖鹽溶液4 ℃過夜脫水，OTC包埋，制備冰凍切片，厚度要求6 μm。冰凍切片室溫復(fù)溫30 min，PBS(pH=7.4)洗3次，每次5 min，10%正常山羊血清封閉120 min。滴加一抗(COL-Ⅰ、COL-Ⅲ 1 ∶100稀釋)4 ℃孵育過夜。按照試劑盒說明操作滴加熒光二抗(1 ∶500稀釋)，DAPI室溫濕盒避光孵育，抗熒光淬滅劑封片。切片由不知道分組情況的研究員顯微鏡下讀片。

2 結(jié)果

2.1 七葉皂苷鈉對大鼠梗阻性黃疸引起的肝纖維化的影響

除假手術(shù)組外，其余各組均于膽管結(jié)扎術(shù)后48～72 h出現(xiàn)黃疸，表現(xiàn)為尿液顏色加深，耳朵、眼睛、毛發(fā)及皮膚黃染，糞便呈淺灰色或陶土色。同一時間七葉皂苷鈉組大鼠在活動、進食及黃疸癥狀等方面均較單純膽管結(jié)扎組大鼠好。解剖實驗大鼠，膽管結(jié)扎組大鼠肝臟均出現(xiàn)腫大、變硬、肝緣變鈍及片狀壞死，個別甚至出現(xiàn)腹腔積液；七葉皂苷鈉組大鼠肝臟情況較膽管結(jié)扎組有顯著改善。HE染色、Masson染色及α-SMA的免疫組化結(jié)果顯示(圖1)，假手術(shù)組大鼠肝臟肝索呈放射狀，未見結(jié)締組織增生，肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無纖維化癥狀；單純膽管結(jié)扎組大鼠肝臟肝索結(jié)構(gòu)紊亂，間隙擴張，空泡增多，并明顯可見肝細胞大片狀壞死現(xiàn)象，炎癥細胞浸潤幾乎布滿整個顯微鏡視野。七葉皂苷鈉組大鼠肝臟肝纖維化程度明顯減輕，肝索排列較整齊，有少量空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)欠規(guī)則。與假手術(shù)組相比，單純膽管結(jié)扎組大鼠肝臟膠原纖維的面積及平均膠原密度等指標均明顯增高，見表1。而七葉皂苷鈉組大鼠肝臟膠原纖維面積及平均膠原密度等指標較單純膽管結(jié)扎組大鼠肝組織顯著減少。七葉皂苷鈉可以明顯減輕梗阻性黃疸模型大鼠引起的肝纖維化。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色、Masson染色、α-SMA的免疫組化染色 ×200

表1 各組大鼠肝組織膠原纖維堆積比較

2.2 七葉皂苷鈉對大鼠梗阻性黃疸繼發(fā)的肝臟膠原纖維的影響

COL-Ⅰ纖維被特異性染成綠色，COL-Ⅲ纖維呈紅色(圖2)。與假手術(shù)組相比，單純膽管結(jié)扎組大鼠肝組織內(nèi)COL-Ⅰ、COL-Ⅲ纖維的表達量均顯著升高。七葉皂苷鈉組大鼠肝臟綠色及紅色纖維束均明顯少于膽管結(jié)扎組大鼠(表2、圖2)。七葉皂苷鈉可以明顯抑制梗阻型黃疸大鼠模型的膠原纖維的產(chǎn)生。

圖2 各組大鼠肝臟膠原纖維免疫熒光 ×200

表2 各組大鼠肝臟COL-Ⅰ、COL-Ⅲ纖維免疫熒光強度比較

2.3 七葉皂苷鈉抑制膽總管結(jié)扎大鼠肝臟匯管區(qū)小膽管增生及膽管細胞內(nèi)4EBP1的磷酸化

由圖3可見，假手術(shù)組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)規(guī)則，匯管區(qū)周圍未見膽管增生，免疫組化染色未見4EBP1的表達以及其磷酸化。膽管結(jié)扎組大鼠肝臟相比假手術(shù)組大鼠肝臟匯管區(qū)周圍可見大量的膽管，且膽管的柱狀上皮細胞內(nèi)可見4EBP1及p-4EBP1明顯表達。七葉皂苷鈉組大鼠肝臟匯管區(qū)周圍僅存在少量的膽管，膽管細胞內(nèi)可見4EBP1陽性表達，而p-4EBP1未見在七葉皂苷鈉組大鼠肝臟內(nèi)陽性表達。七葉皂苷鈉可以明顯抑制梗阻性黃疸大鼠模型引起的膽管增生，并降低小膽管細胞內(nèi)p-4EBP1的表達。

圖3 各組大鼠肝臟HE染色、Masson染色、免疫組化染色結(jié)果

3 討論

近幾年，對于肝纖維化、梗阻性黃疸等疾病研究的越來越多，其病理變化及其防治也研究的越來越透徹，制備梗阻性黃疸動物模型是實驗取得重大進展的重要因素之一，如本課題組前期使用腹腔注射四氯化碳誘使大鼠肝臟損傷，成功構(gòu)建肝纖維化模型。但同時也存在制備動物模型時間長、毒性大、與臨床疾病狀態(tài)不符等缺點。本實驗采用的是SD野生型大鼠，手術(shù)簡便，價格低廉，并能較好地模擬臨床上梗阻性黃疸患者引起的淤膽性肝纖維化，具有代表性。

肝內(nèi)外膽道梗阻致使膽汁排泄不暢是梗阻性黃疸的主要病因，表現(xiàn)為鞏膜、黏膜甚至全身皮膚黃染癥狀。梗阻性黃疸對肝臟損傷最為嚴重，其肝細胞損傷機制較為復(fù)雜，如膽汁酸滯留、血流動力學(xué)紊亂、肝細胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)等均可促進肝細胞壞死。肝纖維化是在多種致病因子的作用下促進肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)激活，HSC激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞表型，并開始表達α-SMA，分泌大量的COL-Ⅰ和COL-Ⅲ并造成細胞外基質(zhì)的過度沉積，最終形成肝纖維化。有研究表明龍血竭總黃酮可以通過抑制HSC的激活及減少膠原纖維的生成和降解，從而達到有效緩解肝纖維化的作用。本課題組前期研究也表明七葉皂苷鈉通過抑制HSC的激活降低COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表達，進而減少細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生實現(xiàn)其抗纖維化作用。而在本研究中，七葉皂苷鈉可以減少梗阻性黃疸大鼠α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表達，因此七葉皂苷鈉可以抑制HSC的激活，改善梗阻性黃疸導(dǎo)致的肝纖維化。

4EBP1是一種重要的蛋白翻譯調(diào)節(jié)因子，主要調(diào)控Cap-依賴型的mRNA的翻譯過程。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路可以對下游靶分子4EBP1發(fā)揮磷酸化的調(diào)控作用，抑制4EBP1磷酸化水平，減少細胞內(nèi)蛋白的表達量，抑制細胞的生長增殖，誘導(dǎo)其凋亡。有研究表明P13K/mTOR信號通路被阻斷后，HSC的收縮、轉(zhuǎn)移等能力受到抑制，COL-Ⅰ纖維的表達量明顯減少，肝纖維化反應(yīng)顯著改善。在本研究中，膽管結(jié)扎組大鼠肝臟匯管區(qū)周圍膽管數(shù)量明顯多于假手術(shù)組，增生的小膽管破壞肝臟組織原本的正常生理結(jié)構(gòu)導(dǎo)致能量代謝障礙，進一步損傷肝組織，導(dǎo)致肝纖維化的產(chǎn)生。而且在增生膽管細胞中4EBP1和p-4EBP1的水平也明顯升高。這表明4EBP1的磷酸化激活參與調(diào)控梗阻性黃疸大鼠肝臟匯管區(qū)周圍小膽管細胞的生長增殖。同時七葉皂苷鈉可以減少梗阻性黃疸大鼠肝組織匯管區(qū)周圍小膽管增生以及膽管細胞內(nèi)p-4EBP1的表達，而不影響4EBP1的表達。本課題組前期研究表明七葉皂苷鈉可以下調(diào)HSC-T6細胞內(nèi)4EBP1的磷酸化水平，從而減少成纖維細胞的產(chǎn)生。另有研究也表明4EBP1的磷酸化激活可以促進COL-Ⅰ蛋白的產(chǎn)生并誘導(dǎo)HSC轉(zhuǎn)化激活,因此可以認為七葉皂苷鈉可以通過抑制膽管細胞內(nèi)p-4EBP1的表達減少梗阻性黃疸大鼠膽管細胞的產(chǎn)生以及匯管區(qū)周圍小膽管的增生。

綜上所述，七葉皂苷鈉可以減少梗阻性黃疸大鼠肝組織匯管區(qū)周圍小膽管的增生，其與4EBP1的磷酸化水平有關(guān)。并且七葉皂苷鈉可以作為臨床治療梗阻性黃疸的潛在藥物，同時七葉皂苷鈉的分子機制是多方面的，該研究僅在動物實驗上觀察到這一現(xiàn)象，尚未進行細胞機制驗證，存在一定的局限性。