成像流式細(xì)胞術(shù)在檢測巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用

方亦龍，韓大飛，檀學(xué)文，許 振，蔣海峰，涂佳杰，魏 偉

經(jīng)典流式細(xì)胞檢測技術(shù)可以從細(xì)胞分子水平上通過抗原-抗體特異性結(jié)合原理對單個(gè)細(xì)胞或亞細(xì)胞層面進(jìn)行精準(zhǔn)、快速的高通量定量分析。該技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)分析成千上萬個(gè)細(xì)胞，獲得每個(gè)細(xì)胞的散射光信號和熒光信號，從而得到細(xì)胞群體的各種統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。目前，經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)利用Cytomics FC500型流式細(xì)胞儀等設(shè)備可用于檢測巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞的能力，但缺少相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞水平信號分布的信息。而成像流式細(xì)胞術(shù)是一種新型檢測技術(shù)，不僅具有經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)，還可實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞高分辨率的數(shù)字成像及細(xì)胞的可視化，獲得細(xì)胞形態(tài)學(xué)、胞內(nèi)分子分布、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞狀態(tài)的變化等數(shù)據(jù)信息，包括細(xì)胞間相互作用、吞噬、凋亡、自噬、核易位和形態(tài)變化等。該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用成像流式檢測技術(shù)，以miR-22對巨噬細(xì)胞吞噬膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響作為檢測指標(biāo)，與經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行比較，為檢測腫瘤細(xì)胞的吞噬能力提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

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1

細(xì)胞株 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

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2

試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國BI公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher公司；miR-22 mimics、陰性對照mimics(NC mimics)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；熒光染料CFSE購自上海貝博生物科技有限公司；CD11b-VioBlue購自德國Miltenyi Biotec公司；Cytomics FC500流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司；ImageStreamX Mark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀購自德國默克密理博公司；SIGMA 3-30 K低溫高速離心機(jī)購自上海納騰儀器有限公司。

1.2 方法

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1

細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7、小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261置于37 ℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用含有10%FBS和1%青-鏈霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行換液、傳代。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度長至80%左右時(shí)開始進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

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2

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2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以1×10/ml的密度將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后設(shè)為對照組(NC mimics組)和miR-22 mimics組。當(dāng)融合率達(dá)80%時(shí)，按照lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1

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2

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3

流式細(xì)胞術(shù)檢測吞噬 GL261細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中消化，用染色工作液重懸，至細(xì)胞濃度大約1×10個(gè)/ml，在37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min后離心收集細(xì)胞。RAW264.7細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的GL261細(xì)胞在37 °C、5%CO濕潤環(huán)境中按3 ∶1的比例混合培養(yǎng)6 h，后將細(xì)胞重懸于100 μl PBS中，并在4 °C下用抗小鼠CD11b標(biāo)記40 min。洗滌細(xì)胞，重懸于100 μl PBS中，用Cytomics FC500流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。每個(gè)檢測指標(biāo)設(shè)3個(gè)復(fù)管，重復(fù)3次。

1

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2

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4

成像流式細(xì)胞術(shù)檢測吞噬 細(xì)胞處理同上，用ImageStreamX Mark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。吞噬比例分析：首先對單陽性樣本進(jìn)行軟件自動(dòng)熒光補(bǔ)償，選擇分析吞噬所需的智能模塊(內(nèi)化)，設(shè)定標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞(Ch07)和GL261細(xì)胞(Ch02)的檢測通道，通過調(diào)整對焦好的單個(gè)細(xì)胞，將RAW264.7細(xì)胞作為核轉(zhuǎn)位分析對象，GL261細(xì)胞(Ch02)設(shè)定為陽性的細(xì)胞群，軟件自動(dòng)劃定吞噬GL261的細(xì)胞并計(jì)算統(tǒng)計(jì)結(jié)果。每個(gè)檢測指標(biāo)設(shè)3個(gè)復(fù)管重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

相關(guān)性分析采用線性回歸和2個(gè)配對樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。一致性評價(jià)采用Bland-Altman法，繪制Bland-Altman圖的橫坐標(biāo)(Average)為(Mark Ⅱ+FC500)/2, 縱坐標(biāo)(Bias)為(Mark Ⅱ-FC500)/[(Mark Ⅱ+FC500)/2]。組間比較采用

t

檢驗(yàn)，以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力

2

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1

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1

經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力的情況 為了觀察經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)檢測效果，利用Cytomics FC500流式細(xì)胞儀檢測RAW264.7細(xì)胞吞噬GL261細(xì)胞的情況，結(jié)果如圖1所示，在散點(diǎn)圖中，PB450單陽為CD11b標(biāo)記的單個(gè)巨噬細(xì)胞，F(xiàn)TTC單陽為CFSE標(biāo)記的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，雙陽為吞噬完成的巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞。與對照組比較，miR-22 mimics組RAW264.7細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞能力增加, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

= 5.291,

P

<0.05)。

圖1 經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞吞噬GL261細(xì)胞的情況A：NC mimics組吞噬GL261細(xì)胞的比例；B：miR-22mimics組吞噬GL261細(xì)胞的比例；C：RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC mimics和miR-22 mimics之后吞噬GL261細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)圖；與NC mimics組比較：*P<0.05

2

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1

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2

成像流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力的情況 為了觀察成像流式細(xì)胞術(shù)檢測效果，利用ImageStreamX Mark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀檢測RAW264.7細(xì)胞吞噬GL261細(xì)胞的情況，結(jié)果如圖2。調(diào)整聚焦好的單個(gè)細(xì)胞見圖2A，將RAW264.7細(xì)胞作為核轉(zhuǎn)位分析對象，GL261細(xì)胞(Ch02)設(shè)定為陽性的細(xì)胞群見圖2B，軟件自動(dòng)劃定吞噬GL261的細(xì)胞并計(jì)算統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見圖2C-2E。與對照組比較，miR-22 mimics組RAW264.7細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞能力增加(

t

=9.720,

P

<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果一致。

圖2 成像流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞吞噬GL261細(xì)胞的情況(n=3)A：聚焦好的單個(gè)細(xì)胞；B：RAW264.7細(xì)胞設(shè)定為核轉(zhuǎn)位分析對象(Ch07)，GL261細(xì)胞(Ch02)設(shè)定為陽性的細(xì)胞群；C：NC mimics組吞噬GL261細(xì)胞的比例；D：miR-22mimics組吞噬GL261細(xì)胞的比例；E：RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC mimics和miR-22 mimics之后吞噬GL261細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)圖；與NC mimics組比較：*P<0.05

2

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1

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3

相關(guān)性和一致性 為了觀察經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)和成像流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力的相關(guān)性和一致性，利用Cytomics FC500流式細(xì)胞儀和ImageStreamX Mark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀檢測RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC mimics和miR-22 mimics之后吞噬GL261細(xì)胞的結(jié)果。結(jié)果的判定系數(shù)R均大于0.8，斜率在1.154～1.457，截距在2.434～-1.135之間，Z值分別為-3.824和-3.724，

P

<0.05，相關(guān)性良好，見表1。Bland-Altman分析顯示, 兩種方法檢測RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC mimics和miR-22 mimics之后吞噬GL261細(xì)胞的百分比的偏倚分別為4.289%和8.073%，偏倚的標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.493 6%和0.711 5%，95%一致性界限分別為(3.321%，5.256%)和(6.679%，9.468%)，Bland-Altman圖如圖3所示，一致性界限范圍較窄。

圖3 經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)和成像流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC mimics和miR-22 mimics之后吞噬GL261細(xì)胞比例的偏倚值圖A：經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)和成像流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞(NC mimics組)吞噬GL261細(xì)胞比例的偏倚值；B：經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)和成像流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞(miR-22mimics組)吞噬GL261細(xì)胞比例的偏倚值

表1 經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)和成像流式細(xì)胞術(shù)檢測技術(shù)的相關(guān)性分析(n=3)

2.2 成像流式細(xì)胞術(shù)觀察RAW264.7細(xì)胞對GL261細(xì)胞進(jìn)行吞噬的過程

與經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)不同的是，成像流式細(xì)胞術(shù)可以結(jié)合圖像清晰地觀察到巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬過程，適用于需要對吞噬過程準(zhǔn)確研究的實(shí)驗(yàn)。利用ImageStreamX Mark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀觀察巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞的過程，如圖4所示：綠色熒光標(biāo)記的是GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞，紫色熒光標(biāo)記的是RAW264.7巨噬細(xì)胞。未吞噬膠質(zhì)瘤細(xì)胞的單個(gè)巨噬細(xì)胞代表圖見圖4A，吞噬完成的巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞代表圖見圖4B。圖4C可見巨噬細(xì)胞正在進(jìn)行吞噬過程的細(xì)胞圖像，可見巨噬細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間吞噬杯的形成。

圖4 成像流式細(xì)胞術(shù)觀察RAW264.7細(xì)胞對GL261細(xì)胞進(jìn)行吞噬的過程A：未吞噬膠質(zhì)瘤細(xì)胞的單個(gè)巨噬細(xì)胞代表圖；B：吞噬完成的巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞代表圖；C：巨噬細(xì)胞正在進(jìn)行吞噬過程的細(xì)胞圖像

3 討論

通過吞噬作用這一過程，巨噬細(xì)胞能夠捕獲和消除轉(zhuǎn)化的惡性細(xì)胞，并將腫瘤來源的抗原呈遞給T細(xì)胞并激活下游的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。近年來腫瘤的免疫治療取得了巨大的進(jìn)步，通過體外基因編輯技術(shù)重新喚醒巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞毒性作用從而對腫瘤起到治療效果。本實(shí)驗(yàn)利用兩種不同流式細(xì)胞技術(shù)檢測miR-22對巨噬細(xì)胞吞噬膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響，同時(shí)獲取細(xì)胞圖像，為進(jìn)一步評價(jià)miR-22對提升吞噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞的能力以及更好地選擇實(shí)驗(yàn)方法提供依據(jù)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)和成像流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力的相關(guān)性和一致性較好，但兩者結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (

P

<0.05)。除了人為的操作原因外，也可能是由于使用不同的儀器和不同的配套試劑所致。不過在實(shí)驗(yàn)過程中，由同一人在同樣操作下上機(jī)檢測，注意樣本的充分混勻、適合的樣本抗體比例、正確的設(shè)門分析和適當(dāng)?shù)碾妷貉a(bǔ)償調(diào)節(jié)等細(xì)節(jié)因素，兩種方法測得百分比結(jié)果的差異可以控制在較小范圍內(nèi)。

經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)因其具有上樣速度快(上機(jī)時(shí)間平均只需1 min)、操作簡單并適用多種標(biāo)本的檢測等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。然而，對于這種經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞只是散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)，而不是真實(shí)的細(xì)胞圖像，并且缺少相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞水平信號分布的信息，因此局限于不要求細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分析；并且細(xì)胞圈門以及熒光強(qiáng)度的調(diào)節(jié)需要專業(yè)人員調(diào)試后方可使用，其結(jié)果受到人為操作因素影響較大。成像流式細(xì)胞術(shù)因其操作簡便，獲取信息多，是近年來快速發(fā)展的新型流式細(xì)胞技術(shù)，它建立在傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)基礎(chǔ)之上，結(jié)合了熒光顯微成像技術(shù)，具有多個(gè)檢測通道，可以對通過流動(dòng)室中的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞圖像進(jìn)行多參數(shù)量化分析，獲得全新的細(xì)胞形態(tài)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。雖然上樣速度慢于經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)，每管平均時(shí)間需3 min，并且選用的洗液為無鈣、鎂離子的PBS，需要更高的成本，但成像流式細(xì)胞分析儀的優(yōu)點(diǎn)很多：使用簡單，無需專用耗材，直接在機(jī)器上用1.5 ml離心管，不需要使用專用的流式管；檢測和分析方案建立方法操作簡單易學(xué)；可自動(dòng)調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度，電壓補(bǔ)償可在檢測完成后調(diào)整；細(xì)胞用量很少，上樣體積只需20～200 μl即可，可適用于樣本細(xì)胞較少或者珍貴樣本的流式檢測；樣本利用率和回收率很高，上樣過后的細(xì)胞仍可以回收用于其他實(shí)驗(yàn)如提蛋白或者提RNA等；特別重要的是，通過成像技術(shù)在分析數(shù)據(jù)時(shí)，可區(qū)分假陽性細(xì)胞，提高樣本檢測的正確率。因此對于吞噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞或者病原體吞噬的研究，如只需要對吞噬統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，選擇上樣簡單、速度快的經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)即可，如需要對吞噬過程準(zhǔn)確研究或者樣本量稀少的實(shí)驗(yàn)可選擇成像流式術(shù)。成像流式既能提供細(xì)胞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又可以結(jié)合圖像清晰觀察到巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬過程，有望在吞噬能力的分析和觀察中得到更為廣泛的關(guān)注。綜上，成像流式細(xì)胞術(shù)可在同等操作下獲得更多實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但實(shí)驗(yàn)儀器的選擇還要取決于具體的實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、檢測指標(biāo)等要求。