單份非血緣臍血移植后血清生物標(biāo)志物對移植后早期并發(fā)癥的預(yù)測作用探究

江慧敏，宋闿迪，皖 湘，姚 雯，耿良權(quán)，孫光宇，范 倩，周紫微，朱小玉，湯寶林，孫自敏，劉會蘭，

造血干細胞移植是治療血液系統(tǒng)惡性疾病成熟有效的手段，非血緣臍帶血移植(umbilical cord blood transplantation, UCBT)作為替代供體之一，為缺乏合適的骨髓或外周血供體的血液病患者帶來了轉(zhuǎn)機。UCBT后獨特的早期免疫反應(yīng)——植入前綜合征(pre-engraftment syndrome, PES)及急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGvHD)、感染等嚴(yán)重早期并發(fā)癥是構(gòu)成UCBT術(shù)后早期發(fā)病率和病死率的重要原因。

近年來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用使造血干細胞移植后血清生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和驗證取得了重大進展。多個研究中心陸續(xù)發(fā)現(xiàn)可溶性腫瘤抑制素2(soluble suppressor of tumorigenicity 2，sST2)、再生胰島衍生蛋白3α(regenerating islet-derived protein 3-alpha，REG3α)和細胞因子腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)對aGvHD具有可靠的診斷、預(yù)測或預(yù)后價值。但是，目前各中心的檢測試劑、標(biāo)本來源不同，能夠最大化體現(xiàn)預(yù)測價值的監(jiān)測時間窗也尚未得到統(tǒng)一。鑒于aGvHD 的中位發(fā)病時間大約在移植后1個月，該研究前瞻性檢測本中心行單份臍血移植后1個月內(nèi)固定時間點的患者血清sST2、REG3α、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8和TNFR1濃度，評估血清生物標(biāo)志物水平與以aGvHD為主的移植后早期并發(fā)癥之間的關(guān)系，為對其進行早期識別和預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 患者和移植物特征

納入2019年7—10月于安徽省立醫(yī)院血液科接受單份UCBT的血液病患者共31例，臍血干細胞來自全國公共臍血庫，供-受者間人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)高分辨配型≥5/8(A、B、Cw、DR)個位點相合。本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署單份UCBT和血清標(biāo)本采集書面知情同意書。

1.2 預(yù)處理方案

31例患者均采用清髓性預(yù)處理方案。① 氟達拉濱(fludarabine，F(xiàn)lu)+ 白消安(busulfan，Bu)+ 環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide，Cy) 23例：Flu 30 mg/m×4 d+Bu 3.2 mg/kg×4 d(兒童Bu劑量按歐洲標(biāo)準(zhǔn))+Cy 60 mg/kg×2 d。② 全身照射(total body irradiation，TBI)+Bu+Cy 8例用于再生障礙性貧血/睡眠性陣發(fā)性血紅蛋白尿(aplastic anemia/paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, AA/PNH)患者：Flu 40 mg/m×5 d+Cy 60 mg/kg×2 d+TBI 4 Gy。

1.3 aGvHD的預(yù)防

使用環(huán)孢菌素A(cyclosporine A，CsA)聯(lián)合霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)用于aGvHD的預(yù)防。CsA：3 mg/(kg·d)，24 h持續(xù)靜脈輸注，回輸前1 d開始，血清CsA平均濃度維持在250～350 mg/L ，至胃腸道功能恢復(fù)后，按照靜脈劑量的2倍改口服, 根據(jù)移植受者是否有aGvHD、血流感染、藥物毒性以及血細胞恢復(fù)情況等調(diào)整免疫抑制劑劑量。無aGvHD發(fā)生及無CsA毒副作用的患者，維持谷濃度100 mg/L至40 d左右，以后遞減，6～9個月左右停藥。MMF：30 mg/(kg·d)，分3次靜脈滴注或口服，D1至D30，無aGvHD者逐漸減量至停用。

1.4 臨床指標(biāo)的定義

以回輸臍血日為D0，中性粒細胞植入是指移植后持續(xù)3 d外周血中性粒細胞絕對值(absolute neutrophil count, ANC)≥0.5×10/L；血小板植入是指移植后不依賴血小板輸注連續(xù)7 d后，持續(xù)3 d外周血血小板絕對值≥20×10/L。原發(fā)植入失敗是指存活時間超過28 d中性粒細胞仍未達到植入標(biāo)準(zhǔn)且伴供者嵌合度進行性下降；繼發(fā)植入失敗是指供者細胞植入后ANC再次持續(xù)降低<0.5×10/L并且供者細胞比例進行性減少從而最終喪失供者植入。aGvHD的診斷和分級依據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 血清生物標(biāo)志物的監(jiān)測

于移植后第0、7、14、21、28天(D0、D7、D14、D21、D28) 采集患者外周血標(biāo)本，室溫自然凝固10～20 min，以2 000～3 000 r/min離心20 min左右，收集上清液于-20 ℃保存。檢測時試劑盒及標(biāo)本應(yīng)室溫平衡至少60 min。采用高度特異的ELISA定量檢測血清sST2、REG3α、IL-6、IL-8和TNFR1濃度，檢測由廣州博富瑞醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司提供技術(shù)支持。

2 結(jié)果

2.1 患者基本特征和移植結(jié)果

如表1所示，31例接受臍血移植患者以兒童為主(中位年齡為12歲)，中位體質(zhì)量為37.9(27.7～53.8)kg，男性和女性分別有19例(61.29%)和12例(38.71%)。8例為AA/PNH，10例為急性髓系白血病,10例為急性淋巴細胞白血病，3例為骨髓增生異常綜合征。供受者HLA等位基因以(5～7)/8相合最常見，回輸?shù)目傆泻思毎麛?shù)和CD34細胞數(shù)的中位數(shù)分別為3.50(2.50～4.70)×10/kg和2.01(1.39～2.76)×10/kg。中性粒細胞和血小板植入的中位時間分別為18(14～22)d和32(29～39) d，觀察期內(nèi)未發(fā)生植入失敗或復(fù)發(fā)。

表1 患者及移植物基本特征[M(IQR)]

2.2 臍血移植后并發(fā)癥

31例患者中，24(77.42%)例發(fā)生PES，中位時間為9(8～13) d，累積發(fā)生率為81.85%(95%

CI

,57.10%～92.30%)。11例出現(xiàn)aGvHD，5例為Ⅰ度，4例為Ⅲ度，2例為Ⅳ度；其中5例僅有皮膚侵犯，3例僅胃腸道侵犯，3例為皮膚、胃腸道均有侵犯，未觀察到肝臟受累，中位發(fā)生時間為25(16～63) d，累積發(fā)生率為35.48%(95%

CI

：16.24%～50.31%)。2例發(fā)生aGvHD的AA/PNH患者中，1例為皮膚Ⅰ度，1例為皮膚、胃腸道IV度。無肝窒阻塞綜合征發(fā)生。移植后D28內(nèi)被發(fā)現(xiàn)細菌、真菌、病毒等感染證據(jù)的患者共有19例，其中16例檢測出巨細胞病毒核酸陽性，粒缺期發(fā)生血流感染7例，其中4例分離培養(yǎng)出緩癥鏈球菌、1例大腸埃希菌、1例陰溝腸桿菌、1例多動物鏈球菌。

2.3 移植后血清生物標(biāo)志物水平變化

在31名患者中縱向評估了5種血清生物標(biāo)志物水平的動態(tài)變化，觀察到臍血移植后患者IL-6、IL-8水平隨時間進展逐漸升高，sST2與TNFR1在D7稍有減低，隨后逐漸升高，于D21達到高峰后再次減低(圖1A)。在各個檢測時間點上，PES-和PES+組的血清生物標(biāo)志物水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。按是否發(fā)生aGvHD分組，aGvHD+患者的sST2和TNFR1水平在5個時間點上均高于aGvHD-患者(表2)，僅D28 sST2水平表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(

Z

=2.236,

P

=0.036)(圖1B)，按是否發(fā)生皮膚aGvHD分組，皮膚aGvHD+患者較皮膚aGvHD-患者的D28 sST2升高(

Z

=2.236,

P

=0.036)(圖1C)。進一步對sST2與TNFR1的相關(guān)性進行分析，二者在D0、D21和D28分別表現(xiàn)為低度相關(guān)(

r

=0.458，

P

=0.019)、中度相關(guān)(

r

=0.633，

P

=0.005)和高度相關(guān)(

r

=0.821，

P

=0.023)，均呈現(xiàn)正相關(guān)。

表2 aGvHD-和 aGvHD+組血清生物標(biāo)志物動態(tài)變化(ng/L)

胃腸道受累的aGvHD患者數(shù)據(jù)較少，無法得出準(zhǔn)確結(jié)果。為避免血流感染對結(jié)果造成影響，以D28內(nèi)是否發(fā)生感染分組，各時間點上兩組間血清生物標(biāo)志物水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1D)。

圖1 血清生物標(biāo)志物的動態(tài)變化及各列分組比較A:UCBT術(shù)后血清生物標(biāo)志物水平動態(tài)變化；B：按有無aGvHD分組，aGvHD+ 和aGvHD-患者血清生物標(biāo)志物水平；C：按有無皮膚aGvHD分組，皮膚aGvHD+和皮膚aGvHD-患者血清生物標(biāo)志物水平；D：按D28前是否存在感染分組，D28前感染-和D28前感染+患者組血清生物標(biāo)志物濃度；1：sST2;2:REG3α;3:IL-6;4:IL-8;5:TNFR1;與aGvHD-組比較：*P<0.05；與皮膚aGvHD-組比較：#P<0.05

3 討論

本研究為一項前瞻性的單中心研究，結(jié)果顯示，單份臍血移植后D28 sST2水平在發(fā)生aGvHD和皮膚aGvHD患者中均升高，sST2與TNFR1之間呈現(xiàn)高度正相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)細菌和病毒血流感染對此5種血清標(biāo)志物水平產(chǎn)生影響。

sST2是可溶性IL-33受體，IL-33與膜結(jié)合受體、IL-1受體附件蛋白結(jié)合形成異三聚體復(fù)合物，誘導(dǎo)2型炎癥細胞因子和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，與aGvHD的病理機制有關(guān)。sST2作為IL-33的誘餌受體結(jié)合并抑制其活性，起負調(diào)控作用。本研究表明單份臍帶血移植后發(fā)生aGvHD的患者在D28 sST2水平增高。多個大樣本的研究中均驗證了sST2水平是aGvHD的獨立預(yù)測因子，移植后第28天是最常見的標(biāo)本采集時間點，與本研究觀點一致。針對皮膚aGvHD中sST2升高的表現(xiàn)，盡管IL-33/ST2通路在皮膚炎性疾病中發(fā)揮了一定作用，但Paczesny et al在2010年的研究中從66個候選生物標(biāo)志物蛋白中排除了sST2作為皮膚aGvHD的潛在預(yù)測因子的可能，sST2在皮膚aGvHD中的確切作用需要進一步探究。

本研究表明sST2與TNFR1水平在D21和D28均表現(xiàn)出了中高度的正相關(guān)性，D28 TNFR1在aGvHD患者血清中的升高并無統(tǒng)計學(xué)意義。關(guān)于TNFR1本身是否可以作為生物標(biāo)志物仍存在爭議，而包含有TNFR1的幾個預(yù)測模型均得到了臨床的有效驗證，這可能因為單獨的TNFR1并不適合作為aGvHD的預(yù)測因子。

REG3α是區(qū)分aGvHD性和非aGvHD性腸炎最有價值的預(yù)測因子之一，本研究中REG3α水平在系統(tǒng)性或胃腸道aGvHD中均未呈現(xiàn)出升高趨勢，這可能與本研究中aGvHD患者數(shù)量較少有關(guān)。血清生物標(biāo)志物濃度變化與細菌、病毒感染無關(guān)，但排除感染之后的宿主血清細胞因子和炎性產(chǎn)物水平將會使結(jié)果更具有說服力。

本研究結(jié)果表明移植后D28sST2水平增高提示aGvHD的發(fā)生，與幾項大樣本的觀察結(jié)果基本一致，Hartwell et al和Vander Lugt et al的研究也發(fā)現(xiàn)了移植后D7和D28 sST2水平升高對aGvHD的預(yù)測價值。

單中心、小樣本和未能在預(yù)處理前測定基線生物標(biāo)志物濃度作為參考是該研究的不足之處，前瞻性、多中心、大樣本的隨機對照研究將有助于進一步了解血清生物標(biāo)志物在預(yù)測、診斷和判斷移植后早期并發(fā)癥預(yù)后方面的具體機制。此外，排除細菌、真菌、病毒等感染引起的免疫反應(yīng)可能會使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

該研究通過前瞻性動態(tài)監(jiān)測臍血移植后血清生物標(biāo)志物濃度，結(jié)果顯示aGvHD患者的D28 sST2水平升高，與先前的多個中心的觀察結(jié)果基本一致。進一步找到適用于臨床的標(biāo)本采集時間點、規(guī)范化檢測方法、試劑來源和標(biāo)本保存方式將會對臨床預(yù)防和治療移植后早期并發(fā)癥起到指導(dǎo)性作用。