原發(fā)性肝癌組織中PKM2、COX2及IAPs的表達及其與放療敏感性的關(guān)系分析

徐明靜，蘆東徽，高世樂，馬 歡，方 向，錢立庭

肝癌是最為常見的惡性腫瘤，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，其中原發(fā)性肝癌起源于肝臟的上皮或間葉組織。我國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)地區(qū)，其死亡率僅次于胃癌、肺癌，是危害性強的惡性腫瘤。目前，原發(fā)性肝癌的具體發(fā)病機制尚不完全明了，可能與慢性肝炎感染、肝硬化、酒精、黃曲霉素、遺傳等因素有關(guān)。三維適形放療是臨床原發(fā)性肝癌常用的治療手段之一，但并不是所有患者都對其敏感。因此，探索相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物監(jiān)測放療敏感度，將有助于患者放療方案的制定與療效的預(yù)測。腫瘤細胞凋亡受多種基因、信使調(diào)控，多項研究表明，M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase，PKM2)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)及凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)可能參與抑制腫瘤細胞凋亡，產(chǎn)生放療抵抗，最終導(dǎo)致放療失敗。但上述蛋白表達與原發(fā)性肝癌的患者放療敏感性關(guān)系的報道較少，故本研究將檢測原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中PKM2、COX2、X關(guān)聯(lián)凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)及細胞內(nèi)凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP-1)蛋白的表達，具體分析其與放療敏感性的關(guān)系，以探討監(jiān)測放療敏感度的潛在標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2018年6月確診為原發(fā)性肝癌患者105例，其中男62例，女43例，年齡45～73(57.23±9.52)歲；病理學(xué)類型：肝細胞癌90例，膽管細胞癌4例，混合型肝細胞-膽管細胞癌11例；臨床分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期29例，Ⅲ期48例，Ⅳ期19例；分化程度：低分化28例，中分化40例，高分化37例；腫瘤直徑≥5 cm者91例，<5 cm者14例；合并乙型病毒性肝炎85例。本次研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)肝臟穿刺活檢病理檢查確診為原發(fā)性肝癌；具有三維適形放療指征；初治病例；臨床資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌；合并有其他惡性腫瘤；伴有心、肝、腎等重要臟器功能障礙；合并全身免疫性疾病；精神異常、神志不清者；存在認知障礙者；治療依從性差。

1.3 方法

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免疫組化法檢測肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達 取活檢組織樣本，行常規(guī)石蠟包埋制片，脫蠟水化后滴加雙氧水，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，水洗后滴加山羊血清室溫下封閉10 min，分別加入PKM2(1 ∶500)、COX2(1 ∶1 000)、XIAP(1 ∶1 000)及cIAP-1(1 ∶500)蛋白一抗工作液，4 ℃下孵育過夜；次日經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗，在加入適量生物素標(biāo)記的蛋白二抗工作液(1 ∶4 000),37 ℃下孵育30 min；經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色3～15 min，充分沖洗后加入蘇木精復(fù)染，最后脫水、透明、封片。

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放療方案 行CT掃描定位，采用三維適形放療技術(shù)，應(yīng)用瓦里安加速器6MV-X射線照射，總照射劑量為60 Gy，2 Gy/次，1次/d，每周照射5次。

1.4 療效評估

參照實體瘤療效判定標(biāo)準(zhǔn)，將患者劃分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定及進展，其中治療有效率=(完全緩解+部分緩解+穩(wěn)定)/總例數(shù)×100%，完全緩解和部分緩解為放療敏感組，穩(wěn)定和進展者為放療不敏感組，比較不同放療效果和敏感性患者癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達的差異。

1.5 隨訪

隨訪至2020年6月30日，通過門診復(fù)查形式，隨訪頻率為3個月/次，記錄患者復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和生存率。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白的表達

本組105例患者肝癌組織中PKM2蛋白陽性86例，陰性19例，陽性率為81.90%；COX2蛋白陽性78例，陰性27例，陽性率為74.28%；XIAP蛋白陽性90例，陰性15例，陽性率為85.71%；cIAP-1陽性表達87例，陰性18例，陽性率為82.86%。免疫組化檢測結(jié)果見圖1。

圖1 肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白的表達 ×400A：女性，60歲，PKM2陰性表達(-)；B：男性，76歲，PKM2陽性表達(3+)；C：男性，59歲，Ⅲ期，COX-2蛋白陰性(-)；D：男性，70歲，IV期，COX-2蛋白陽(3+)；E：男性，71歲，Ⅱ期，XIAP蛋白陽性(1+)；F：女性，55歲，Ⅲ期，XIAP蛋白陽性(3+)；G：女性，46歲，Ⅳ期，cIAP蛋白陽性(1+)；H：男性，66歲，Ⅳ期，cIAP蛋白陽性(3+)

2.2 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達與放療治療效果的關(guān)系

COX2、XIAP蛋白陽性表達者治療有效率與陰性者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，但不同PKM2、cIAP-1蛋白表達者治療有效率的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)，見表1。

表1 不同放療效果患者PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達的比較

2.3 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達與放療敏感性的關(guān)系

放療敏感患者臨床分期、分化程度、腫瘤直徑、肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達情況與放療不敏感者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

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<0.05)；但兩組患者年齡、性別、病理學(xué)類型及是否合并乙型病毒性肝炎情況的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)，見表2。

表2 患者放療不敏感的單因素分析(n)

2.4 患者放療不敏感的多因素分析

以患者是否放療敏感(敏感=0，不敏感=1)為因變量，上述有統(tǒng)計學(xué)意義的因素作為自變量，臨床分期(Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4)、分化程度(高分化=1，中分化=2，低分化=3)、腫瘤直徑(<5 cm=1，≥5 cm=2)、肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(陰性表達=1，陽性表達=2)分別賦分后納入Logistic回歸模型，結(jié)果顯示高臨床分期、低分化程度、COX2、XIAP陽性表達是患者放療不敏感的獨立危險因素(

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<0.05)，見表3。

表3 患者放療不敏感的多因素分析

2.5 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系

截止至隨訪日期，105例患者中22例復(fù)發(fā)，27例轉(zhuǎn)移，88例存活；XIAP陽性表達者復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率與陰性表達者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；但不同PKM2、COX2、cIAP-1蛋白表達者復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率、死亡率及不同XIAP表達患者的死亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

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>0.05)，見表4。

表4 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

原發(fā)性肝癌的臨床治療中，常對病灶處使用局部放射療法，以快速殺滅局部癌細胞及鄰近侵染細胞，但是實際治療過程中，不同的患者對放射治療表現(xiàn)出不同的敏感性，除了病理特征的影響外，還與患者自身個體化差異有關(guān)。因此，在原發(fā)性肝癌的治療中，有效監(jiān)測患者的放療敏感性對于患者的個性化治療尤為重要。

PKM2是人體有氧糖酵解中的關(guān)鍵限速酶，其高水平代表糖酵解途徑可為腫瘤細胞生長和增殖提供更多的能量和物質(zhì)，這為腫瘤細胞的惡性增殖創(chuàng)造了有利條件。Liu et al研究顯示，PKM2甲基化激活有氧糖酵解后，將促進腫瘤的發(fā)生。Long et al研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在肺癌組織中高表達，并對患者預(yù)后有一定的預(yù)測能力。COX2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的重要限速酶，正常生理狀態(tài)下，COX2處于較低水平，當(dāng)細胞接受某些細胞因子、內(nèi)毒素、癌基因等刺激時，會大量產(chǎn)生COX2，介導(dǎo)多種蛋白酶、炎性介質(zhì)等引起炎癥反應(yīng)，參與多種疾病的發(fā)生。另外，COX2還可通過前列腺素途徑促進腫瘤的增殖，并抑制其凋亡。近年來研究證實，COX2在多種腫瘤組織中呈高表達，如肺癌、胃癌等，并與患者病理特征、預(yù)后有關(guān)。IAPs可抑制多種刺激觸發(fā)的凋亡，包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2等8個成員，其特殊的桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)序列，可有效抑制細胞凋亡蛋白酶半胱天冬酶(caspase)。汪靈 等研究指出，XIAP、cIAP-1和caspase-3在乳腺癌組織中高表達，XIAP和caspase-3可作為潛在的預(yù)后評估指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達陽性率分別為81.90%、74.28%、85.71%及82.86%，與既往研究結(jié)果基本相符。

細胞凋亡不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還與治療敏感性密切相關(guān)。馬歡 等回顧性分析80例肝癌患者臨床資料，發(fā)現(xiàn)PKM2在肝癌組織中陽性率高，且與放療敏感性密切相關(guān)。Cheki et al研究顯示，COX2在誘導(dǎo)腫瘤細胞對放療抵抗中有重要作用，可能是放療防護和放療增敏的潛在靶點。細胞實驗也表明，XIAP、cIAP-1表達與腫瘤細胞放療敏感性有關(guān)。本研究中，COX2、XIAP蛋白陽性表達者治療有效率明顯低于陰性者，PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白陽性表達者放療敏感率也低于陰性者，表明肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1陽性表達可能放療效果不佳。探究原發(fā)性肝癌患者放療不敏感的影響因素發(fā)現(xiàn)，高臨床分期、低分化程度、COX2、XIAP陽性表達均是患者放療不敏感的獨立危險因素，可能是COX2高表達影響前列腺素代謝，加快細胞分裂，促進新生血管的形成，有利于腫瘤細胞的生長；而XIAP是最具有潛在抑制活性的IAPs成員，可直接抑制凋亡蛋白酶活性，抑制腫瘤細胞的凋亡，因此，COX2、XIAP陽性表達患者放療不敏感的風(fēng)險也越高。另外，隨訪結(jié)果顯示，肝癌組織中XIAP表達還與患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。故放療前COX2、XIAP表達的評估對于原發(fā)性肝癌患者有重要的臨床意義。同時，對于COX2、XIAP陽性表達者，可在放療前應(yīng)用COX2、XIAP抑制劑，這可能是增加放療敏感性和改善患者預(yù)后的新思路。