MANF對A2型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增殖、凋亡的影響

劉 銳,丁振飛,戴 策,鐘 林,汪蕭和,尹宗生,高維陸

星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)系統(tǒng)中所占的比例最大，在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中分布最為廣泛，也是膠質(zhì)細胞中體積最大的一種。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細胞能夠?qū)Σ煌再|(zhì)的刺激做出不同的反應(yīng)，活化為具有消極作用的A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞(reactive astrocytes,RAS)和有積極作用的A2型RAS。有研究表明，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可以使星形膠質(zhì)細胞向A2型RAS轉(zhuǎn)化。中腦星形膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中。MANF能夠在多種細胞中發(fā)揮生物學功能。但其在脊髓損傷中對RAS的影響卻未見相關(guān)文獻報道。該研究擬通過在體外進行大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)，并制備A2型RAS，采用不同濃度的MANF處理，并檢測其對A2型RAS增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；重組MANF蛋白、小鼠抗S100A10單克隆抗體(美國R&D Systems公司)；CCK-8試劑(上海陶素生化科技有限公司)；鏈霉素-青霉素、EdU試劑盒、TUNEL試劑盒(上海Beyotime生物技術(shù)公司)；兔抗GFAP單克隆抗體(美國Abcam公司)。倒置熒光顯微鏡(德國蔡司公司)，酶標儀(美國PE公司)。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠50只，3～4周齡，雌雄不拘，由安徽省實驗動物中心提供。

1.3 方法

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星形膠質(zhì)細胞的制備 SD大鼠脫頸處死后，在無菌條件下取出脊髓組織，迅速轉(zhuǎn)入含有用冰預冷的PBS液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，反復吹打后經(jīng)200目細胞篩過濾，濾液收集于15 ml離心管中，轉(zhuǎn)入離心機離心5 min，轉(zhuǎn)速為800 r/min，然后棄上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液2 ml，之后用槍頭反復吹打細胞懸液使其重懸均勻。將細胞密度調(diào)整為5×10/ml，分裝接種到培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)至第14天，將細胞瓶固定于37 ℃恒溫搖床，120 r/min振蕩18 h。棄去培養(yǎng)基，以新鮮的培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)瓶2遍。加入胰酶，當細胞由多角形變成圓形，細胞間隙變大，胞體變亮，小心棄去胰酶。加入新鮮的培養(yǎng)基將細胞重懸成單細胞懸液，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

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星形膠質(zhì)細胞的鑒定 待細胞融合度達到80%左右時，經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定、0.3% TritonX-100室溫下通透，正常羊血清工作液室溫封閉后，加入兔抗GFAP單克隆抗體，4 ℃過夜，再加入FITC標記的羊抗兔IgG，避光保存，室溫孵育1 h。DAPI避光孵育染核20 min，滴加抗熒光淬滅封片甘油，封片后熒光顯微鏡觀察。

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A2型RAS的制備及鑒定 取對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細胞，在細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為10 ng/ml的IL-1β，放入37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)3 d后，行免疫熒光染色，方法同上，所用一抗為兔抗GFAP單克隆抗體和小鼠抗S100A10單克隆抗體，二抗為FITC標記的羊抗兔IgG和TRITC標記的羊抗小鼠IgG。以未經(jīng)IL-1β處理的星形膠質(zhì)細胞為對照組。

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CCK-8實驗 取生長正常的A2型RAS接種至96孔板中，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的(0、0.5、1、2 μg/ml)MANF蛋白，放入37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄各孔培養(yǎng)基，向每孔加入90 μl培養(yǎng)基、10 μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。而后再用酶標儀測定450 nm處的吸光度，該實驗重復3次。采取同上的方法，加入終濃度1 μg/ml MANF蛋白，分別在12、24、36、48 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度，該實驗重復3次。

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5-乙炔基-2-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)摻入試驗 取生長狀態(tài)正常的A2型RAS接種至24孔板中，細胞貼壁后分3組進行試驗，空白組只加細胞，Control組加入2×的EdU，MANF組加入2×的EdU和終濃度1 μg/ml的MANF蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行熒光檢測。該實驗重復3次。

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TUNEL實驗 取生長狀態(tài)正常的A2型RAS接種至24孔板中，細胞貼壁后分為2組，空白對照組不做任何處理，MANF組加入終濃度1 μg/ml的MANF蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入TUNEL檢測液孵育60 min后進行熒光檢測。該實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)與鑒定

大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞分離培養(yǎng)14 d后用倒置顯微鏡觀察細胞基本鋪滿培養(yǎng)皿底(圖1A)，將細胞瓶固定于37 ℃恒溫搖床，120 r/min振蕩18 h后傳代，第2天可見純化的星形膠質(zhì)細胞呈星形，從胞體發(fā)出許多長而分支的突起(圖1B)。免疫熒光結(jié)果顯示絕大多數(shù)細胞呈GFAP陽性，顯綠色熒光(圖2)即為星形膠質(zhì)細胞。DAPI染核，胞核呈藍色，為總細胞數(shù)，可見星形膠質(zhì)細胞純度較高。

圖1 大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞 ×40A:星形膠質(zhì)細胞原代14 d；B：純化后傳代2d的星形膠質(zhì)細胞

圖2 星形膠質(zhì)細胞的鑒定 ×100

2.2 A2型RAS的鑒定

根據(jù)A2型RAS特定表達S100A10的特性，應(yīng)用細胞免疫熒光方法染色結(jié)果顯示IL-1β處理的實驗組可見A2型RAS特異性蛋白S100A10被染成紅色，未處理空白對照組僅有少量紅色，DAPI復染后細胞核呈藍色，提示絕大多數(shù)細胞為A2型RAS。見圖3。

圖3 A2型RAS細胞的鑒定 ×100

2.3 MANF蛋白對A2型RAS增殖具有時間和濃度依賴性

CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的MANF蛋白(0.5、1、2 μg/ml)對A2型RAS具有促進增殖的作用(圖4A)，而且不同作用時間(12、24、36、48 h)促進增殖的能力不同(圖4B)，呈時間和濃度依賴性(

P

<0.05)；當濃度達到2 μg/ml時促增殖的效果最好，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(

t

=9.951，

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<0.05)，在12 h的細胞增殖活力與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 MANF蛋白對A2型RAS增殖的影響A：不同濃度MANF對A2型RAS的影響 ；B：不同作用時間對A2型RAS的影響 ；與Control組比較：*P<0.05

2.4 MANF蛋白對A2型RAS增殖有促進作用

為了研究MANF對A2型RAS增殖的影響，進行了EdU摻入試驗，分析細胞增殖情況。結(jié)果顯示與對照組(25.5%)相比，MANF組(44.5%)的EdU陽性細胞數(shù)量增加了(圖5、6)，這些數(shù)據(jù)表明MANF對A2型RAS增殖具有促進作用。

圖5 EdU檢測細胞增殖的效果圖 ×100

圖6 EdU陽性細胞所占的比例與Control組比較： **P<0.01

2.5 MANF蛋白對A2型RAS凋亡具有抑制作用

為了研究MANF對A2型RAS的凋亡的影響，因此，進行TUNEL分析細胞凋亡的情況。圖7為倒置顯微鏡下明場拍攝的A2型RAS，圖8為TUNEL染色陽性細胞，與Control組(凋亡的陽性對照)細胞相比，MANF組的細胞中僅觀察到少量TUNEL陽性染色，這表明MANF可以抑制細胞凋亡。

圖7 TUNEL檢測細胞凋亡的效果圖 ×200

圖8 凋亡細胞所占比例與Control組比較：*P<0.05

3 討論

星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所占的比例最大，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和生理功能的基礎(chǔ)。星形膠質(zhì)細胞對缺血、感染、創(chuàng)傷及退行性改變等各種形式的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害都能迅速做出反應(yīng)，在形態(tài)和功能上發(fā)生劇烈的變化，形成RAS。最近，有研究者在制備了炎性和缺血性病變兩種不同性質(zhì)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷小鼠模型后，分離培養(yǎng)兩種損傷模型小鼠的RAS，研究者將炎性病變誘導產(chǎn)生的RAS命名為A1型RAS，缺血性病變誘導產(chǎn)生的RAS命名為A2型RAS。其中A1型RAS上調(diào)許多經(jīng)典的補體級聯(lián)基因，這些基因?qū)ν挥|具有破壞性，因此推測A1型RAS可能發(fā)揮消極的作用。而A2型RAS能夠分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，因此推測A2型RAS可能發(fā)揮積極的作用。有研究表明，A2型RAS能夠促進抗炎細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β的表達。該因子有助于軸突形成和神經(jīng)保護的作用。

大量的證據(jù)表明MANF在多種疾病中均具有保護作用，包括腦缺血、心肌梗塞、視網(wǎng)膜變性。最近有研究證明其可通過抑制眼部組織炎性細胞因子的表達，從而抑制自身免疫性葡萄膜炎。體外細胞培養(yǎng)實驗同樣證明MANF蛋白能夠激活促存活信號通路。本研究以大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞為研究對象，通過對A2型RAS的制備，觀察不同濃度MANF對A2型RAS增殖活力的影響，結(jié)果顯示，MANF可促進脊髓A2型RAS增殖并抑制其凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)修復作用。本研究可能為脊髓損傷的治療提供一個新的思路，但本研究也存在著一定的不足，MANF對促進A2型RAS增殖并抑制其凋亡具體分子機制尚未明確，后續(xù)還需進行更深入的研究。