水解橄攬植物水對小鼠的抗炎作用

凱瑟琳·比爾特

摘要：水果和蔬菜中的簡單多酚是有效的抗氧化劑。3，4-二羥基苯基乙醇或羥基酪醇 （HT， hydroxytyrosol）是清除自由基最有效的物質(zhì)之一，這是一種主要存在于歐洲油橄欖或橄欖植物中的簡單酚。H在橄欖果肉的含水部分中含量最高，在橄欖油部分和葉子中也有痕量。對于這些實驗結果，我們評估了橄欖植物水（OVW， olive vegetation water）的抗炎活性，我們之前證明它具有強大的抗氧化活性。由于一些具有抗氧化活性的簡單多酚類物質(zhì)顯示出不同的抗炎活性，我們測試了OVW和HT抑制腫瘤壞死因子（TNF- ）產(chǎn)生的能力，TNF-是炎癥中的關鍵細胞因子。在經(jīng)脂多糖 （LPS） 處理的BALB/c小鼠炎癥模型中以 125 毫克/小鼠 （500 毫克/千克） 的劑量注射OVW將降低95%血清中的TNF-水平。在人單核細胞系THP-1中，以0.5 g/L（相當于0.03 g/L簡單多酚）濃度的OVW處理細胞可降低50%由LPS誘導的TNF-含量。 同時，OVW在體外或體內(nèi)沒有毒副作用。當OVW與葡糖胺（一種蛋白聚糖和糖蛋白，可減少培養(yǎng)的巨噬細胞中誘導型一氧化氮合酶的產(chǎn)生）結合時，這兩種化合物協(xié)同作用以降低經(jīng)LPS誘導的小鼠血清中TNF-水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，OVW和氨基葡萄糖的組合可能是治療多種炎癥過程的有效方法，包括了類風濕性和骨關節(jié)炎等疾病。

關鍵詞：橄欖、炎癥、細胞因子、抗氧化劑

【中圖分類號】R4 ? ? ? ? ? ? 【文獻標識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）09--05

地中海飲食，因其富含水果、蔬菜和魚類可大幅降低疾病發(fā)病率并改善整體健康狀況 [1-3]。許多可通過地中海飲食影響、調(diào)整的疾病，包括癌癥、糖尿病和心血管疾病中均含有炎癥因子，或經(jīng)炎癥介質(zhì)而發(fā)生惡化。伴隨炎癥而來的是活性氧 （ROS， reactive oxygen species）3 或自由基的產(chǎn)生，它們會增加蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化，從而產(chǎn)生引發(fā)更多炎癥的信號。地中海飲食的健康益處歸因于高濃度的清除自由基的簡單多酚和類黃酮。橄欖果是此類飲食的主要組成部分，因其油成分（主要是油酸）和抗氧化酚類物質(zhì)而對健康特別有益。

橄欖酚類物質(zhì)在所有已知天然抗氧化劑中是具備最高的抗氧化活性的物質(zhì)。橄欖酚類物質(zhì)表現(xiàn)出抑制LDL氧化和血小板聚集、清除超氧化物和其他ROS、清除次氯酸、抑制中性粒細胞呼吸爆發(fā)并增加血漿抗氧化能力[4]。 羥基酪醇 （HT） 是一種在結構上與咖啡酸相關的橄欖酚類物質(zhì)，顯示可抑制自由基生成、清除活性氧和氮、抑制大鼠吸煙引起的氧化應激并提高血漿抗氧化能力[5-10]。

除了作為抗氧化劑的活性外，一些簡單多酚類物質(zhì)還顯示出具有抗炎活性。例如，從紅酒和紅茶中提取的多酚化合物可調(diào)節(jié)細胞中的環(huán)氧合酶 2 （COX-2） 活性和 COX-2基因表達[11]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是主要的綠茶多酚，可劑量依賴性地降低人巨噬細胞系中脂多糖（LPS）誘導的腫瘤壞死因子（TNF-）的產(chǎn)生[12]。在體內(nèi)，給BALB/c小鼠服用綠茶多酚后，LPS誘導的血清TNF-降低了80% [12]。

在本研究中，研究了橄欖植物水 （OVW） 對LPS處理的人THP-1細胞和LPS處理的BALB/c小鼠的影響。葡萄糖胺是糖蛋白和蛋白聚糖的重要組成部分，在人體關節(jié)炎試驗中具有療效，也進行了相應評估。最后，測量OVW和葡糖胺對TNF-產(chǎn)生的聯(lián)合作用，以確定這些化合物是否協(xié)同作用以減輕炎癥癥狀。

材料與方法

試劑

RPMI培養(yǎng)基和胎牛血清 （FBS） 購自 GIBCO。TNF- ELISA試劑盒購自R&D Systems;3，4-二羥基苯基乙醇 （HT） 購自Cayman Chemical。橄欖苦苷購自Indofine Chemical，葡糖胺購自 Protein Research Labs。Trolox、1，1-二苯基-2-苦基肼、地塞米松 （DEX）、LPS 和 Folin 試劑購自Sigma。包括咖啡酸、沒食子酸、酪醇、兒茶酚和原兒茶酸在內(nèi)的標準品以及所有其他試劑均購自Sigma。

樣品準備

在2000-2001作物年度收集的曼薩尼亞橄欖果實首先去核，然后無核果肉被機械壓榨以產(chǎn)生液相混合物，包括橄欖油、植物水和固體。通過過濾和8000g離心40分鐘從液相混合物中除去固體。油和水部分進行重力分離，并潷析水相。在經(jīng)HPLC分析之前，OVW用1%檸檬酸處理6個月。對于體外和體內(nèi)研究，OVW通過冷凍干燥，產(chǎn)生含有至少 6%多酚的淺棕色結晶產(chǎn)品（OVW特指OVW的凍干粉形式）。

酚類成分分析

將凍干的橄欖提取物以100 g/L的濃度重新懸浮在水中，并在Beckman-Coulter 125 NM 系列系統(tǒng)上通過HPLC對樣品進行評估，該系統(tǒng)由 125 NM 系列泵、166 NMP 系列檢測器和分析型 Ultrasphere 反相色譜柱（C-18;150 4.6 mm 內(nèi)徑）組成。如Romani等人所述，通過梯度洗脫實現(xiàn)分離[13]。使用Beckman 32 Karat軟件收集和分析數(shù)據(jù)。通過在5個不同波長（220、240、280、320和340 nm）下分析標準品的保留時間和吸收來鑒定并確認化合物。通過將 OVW 中的HT與各種濃度純HT的HPLC分析進行比較，確定該OVW中HT的濃度為 17 mg/g。

氧自由基吸收能力 （ORAC）

ORAC來評估 OVW、凍干OVW、橄欖油、橄欖葉和純HT的抗氧化活性。 ORAC基本上按照Brunswick實驗室Cao 等人的描述方法進行[14]。使用Trolox濃度和曲線下面積 （AUC） 之間的回歸方程計算最終ORAC值，并表示為液體樣品的mol Trolox當量/L或固體樣品的當量/g。

THP細胞中的TNF-的測量

人單核細胞系THP-1從ATCC獲得。 在細胞刺激處理前將OVW或HT添加到 96 孔微量滴定板中的THP-1細胞中預處理1小時，隨后在37℃下用 LPS （10 g/L） 刺激細胞 3 小時。 LPS 刺激后，以200 g離心20分鐘收集上清液，并通過ELISA評估 TNF-的水平。其中DEX （100 nmol/L，一種 TNF 釋放抑制劑）用作陽性對照。

體內(nèi)TNF-含量

小鼠 （Charles River Laboratories） 的處理遵守美國農(nóng)業(yè)部動物福利法中概述的規(guī)定和 NRC指南中規(guī)定的條件。所有協(xié)議均經(jīng)IACUC批準。至少每天觀察小鼠的疾病或痛苦跡象。本研究中使用的小鼠是體重20–25g的未經(jīng)產(chǎn)的非妊娠BALB/c小鼠。小鼠在接收和隔離3天后被安置在獨立設施的專用房間中。初級圍欄符合美國農(nóng)業(yè)部動物福利法案（9 CFR，第 1、2和3部分）和 NRC 指南中的描述。小鼠被圈養(yǎng)4只/籠。房間通風（12次換氣/小時），100%新鮮空氣（無空氣再循環(huán)）。保持12小時光：暗光周期，除非在黑暗周期打開室內(nèi)燈以適應血液采樣或其他研究程序。室溫保持在18到26℃之間。在測試前允許小鼠自由進食和飲水。標準嚙齒動物飲食（Prolab? RMH 2500;PMI Nutritional International）由24%的蛋白質(zhì)、10.5%的脂肪、49%的碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素組成。實驗前一天，小鼠禁食24小時。在禁食期結束時，給小鼠灌胃給予不同劑量的OVW或氨基葡萄糖或OVW氨基葡萄糖（“試驗品”），讓小鼠休息12小時。通過口服管飼法給對照小鼠喂水。在食物剝奪和治療后期間，隨意飲用水。OVW由約6-10%的多酚（3% HT）、65%的碳水化合物、20%的脂肪和 6%的蛋白質(zhì)組成。 12小時后，通過口服強飼法給小鼠第二劑試驗品。1小時后，他們通過腹腔注射LPS（50克水溶液）。在LPS治療后2小時，根據(jù)美國獸醫(yī)協(xié)會安樂死專家組的建議，在用異氟醚麻醉的情況下通過頸椎脫臼處死小鼠;通過眶后出血收集血液。血液在4℃下凝固12小時。血液凝固后，以 1000 g離心10分鐘，然后收集血清用于通過ELISA測量TNF-水平。

協(xié)同作用的確認

為了確定OVW和氨基葡萄糖是否對LPS誘導的體內(nèi)炎癥具有協(xié)同作用，我們進行了先前描述的等值線分析 [15]。 對于該分析，獲得了2個系列的劑量曲線。首先，使用固定濃度的OVW，生成抑制曲線;然后，使用固定濃度的氨基葡萄糖，生成另一組抑制曲線。確定每種化合物的85%有效劑量 （ED85） 值并用于繪制等效線圖。OVW和氨基葡萄糖的組合產(chǎn)生的效果低于可加性線，表明具有協(xié)同作用。

統(tǒng)計分析

結果表示為至少 10 個獨立測量的平均值SEM。 通過單向方差分析來分析數(shù)據(jù)以確定各組之間的顯著差異，然后進行Dunnett后檢驗以將每個測試條件與LPS處理的細胞進行比較。 當P 0.05時，差異被認為是顯著的。

實驗結果

來自去核有機橄欖的營養(yǎng)水的組成

水解OVW的HPLC結果顯示，4.7、9、12 和 29 分鐘的主要保留峰分別對應于HT、酪醇、咖啡酸和橄欖苦苷（圖 1），沒有可檢測到的兒茶酚、原兒茶酸或高香草酸，有時出現(xiàn)在“廢水”中，或從壓榨含有核的橄欖中獲得的汁水[16-17]。 在較高波長下，復雜分子如橄欖苦苷、毛蕊花苷和肉桂酸衍生物很明顯（結果未顯示）;然而，這些分子在OVW中的濃度小于 HT總含量的10%;因此，檢測到的最豐富的苯酚是HT。

抗氧化活性和酚類含量的比較。

與橄欖油相比，水性和冷凍干燥的OVW具有更多的總酚類物質(zhì)和更好的氧自由基吸收能力（表1）。冷凍干燥橄欖水餾分（由11%的固體組成）導致總酚類物質(zhì)的百分比增加>10 倍，同時ORAC活性也相應增加，這表明冷凍干燥不會損害餾分的活性。此外，最近表明，冷凍干燥是保持食品酚類完整性的首選方法（18）。橄欖油的HT和橄欖苦苷含量無法檢測，而水性和凍干OVW的HT和橄欖苦苷的相對濃度分別為50%和11%（表1）。令人感興趣的是，高度富含HT的OVW除抗氧化活性外是否還具有其他活性，以及HT是否有特別功效。

OVW降低THP-1細胞中的TNF-水平

為了檢查 OVW 對炎癥相關細胞因子表達的影響，我們首先評估了對TNF-在人類單核細胞系 THP-1 中產(chǎn)生。 相對于對照（僅 LPS 處理;圖 2）OVW 顯著降低TNF-含量。而HT則不影響TNF-的表達。

OVW降低小鼠體內(nèi)TNF-的表達

為了確定上述發(fā)現(xiàn)是否適用于體內(nèi)模型，我們評估了OVW在炎癥小鼠模型中的作用。以35 mg OVW每只小鼠的劑量處理小鼠（1.4 g/kg;圖 3），發(fā)現(xiàn)OVW 顯著降低LPS誘導的TNF-的產(chǎn)生。在以125 mg OVW每只小鼠 （5 g/kg）的劑量條件下，TNF-表達量減少至少90%，沒有觀察到明顯的毒性。上述實驗結果表明OVW對體內(nèi)TNF-的產(chǎn)生具備潛在的抑制效應。

氨基葡萄糖降低小鼠體內(nèi)TNF-的表達

試驗時，雌性 BALB/c小鼠在用LPS刺激前12小時和1小時通過口服管飼法給予不同濃度的氨基葡萄糖。 實驗結果顯示，氨基葡萄在6.2毫克/小鼠 （248毫克/千克）給藥劑量下顯著抑制LPS誘導的TNF-的產(chǎn)生，而在50毫克葡萄糖胺/小鼠給藥劑量下完全抑制TNF-的產(chǎn)生（圖 4）。

OVW與氨基葡萄糖通過協(xié)同作用保護小鼠免于經(jīng)LPS誘導的體內(nèi)TNF-的產(chǎn)生

OVW和氨基葡萄糖可以單獨給藥，也可以聯(lián)合給藥，其給藥濃度均可達到預計產(chǎn)生陽性結果的濃度。實驗結果顯示所有的OVW和氨基葡萄糖組合均可抑制LPS誘導的小鼠體內(nèi)TNF-的產(chǎn)生（圖5）。實驗比較了35 mg OVW和12.5 mg 葡糖胺單獨使用與35 mg OVW + 12.5 mg葡糖胺組合對小鼠體內(nèi)TNF-抑制的百分比，實驗結果證實了OVW與葡糖胺聯(lián)合使用后其抗炎效果是相疊加的，其抑制TNF-產(chǎn)生的百分比遠大于通過將其中一種成分的濃度加倍使用所預測的抑制百分比。因此，橄欖提取物和氨基葡萄糖的組合比單獨添加使用更具協(xié)同作用（圖 6）。此外，還通過等效輻射分析以評估二者的協(xié)同作用（圖 7）。在選取了兩種化合物中的每一種的ED85值并檢查了 OVW 和葡糖胺的可能協(xié)同作用。在OVW的ED85和單獨的氨基葡萄糖的ED85獲得的數(shù)據(jù)點之間繪制的直線預測了二者抑制TNF-產(chǎn)生的效果，如果2種化合物的組合產(chǎn)生累加效應則OVW 和氨基葡萄糖的組合低于該線，表明化合物之間存在協(xié)同相互作用。

討論

在上述研究中，我們描述并分析了去核橄欖水解OVW的組成和活性。評估了OVW在LPS誘導的炎癥小鼠模型中抑制TNF-產(chǎn)生的作用。我們發(fā)現(xiàn)以這種方式生產(chǎn)的橄欖水餾分具有獨特的簡單多酚的特征，與橄欖油和橄欖廠廢水不同，其HT是主要的酚類組分。

羥基酪醇在體外和體內(nèi)實驗中均表現(xiàn)出有效的抗氧化、抗血栓形成和抗微生物能力。例如，HT被證明可以抑制自由基的產(chǎn)生，清除活性氧和氮，抑制大鼠吸煙引起的氧化應激，并增加血漿抗氧化能力[5-10]。HT還具有心臟保護活性，由于它可以抑制LDL氧化，可降低動脈粥樣硬化的風險[1-20];抑制血栓形成時發(fā)生的血小板聚集[21];保護細胞免受在缺血和再灌注損傷期間發(fā)生的活性氧中間體而導致的細胞死亡[22];并抑制多種致病性革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的生長[23]。最后，在人體試驗中，食用多酚含量高的橄欖油（特別是HT和酪醇）可呈劑量線性降低導致氧化的LDL含量，同時也可降低線粒體DNA中 8-oxo-7，8-dihydro-2-deoxyguanosine含量與尿丙二醛水平[24-25]。

在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)在一種關節(jié)炎模型中OVW顯著降低了TNF-在經(jīng)LPS處理的THP-1細胞中的含量。TNF-是該系統(tǒng)中誘導的主要細胞因子，并且是導致單核細胞炎癥反應持續(xù)存在的細胞因子。有趣的是，OVW中存在的主要酚HT可減弱TNF-在這個細胞系統(tǒng)中生產(chǎn)。我們評估了純HT在其他抗炎細胞模型中的有效性，發(fā)現(xiàn)它在這些模型中無效（未發(fā)表的結果）。因此，雖然水解橄欖水的主要酚類成分是 HT，但抗炎活性可能歸因于水解產(chǎn)物的另一種尚未鑒定的成分。

為了確定OVW的有效性，我們在炎癥的體內(nèi)模型經(jīng)LPS刺激處理的BALB/c小鼠體內(nèi)測試了OVW的活性。先前的研究表明，其他簡單多酚能夠減輕或抑制由多種誘導劑引起的炎癥反應。例如，紅茶提取物被證明可以減弱內(nèi)毒素誘導的體內(nèi)白細胞介素IL-6的產(chǎn)生 [26]。 EGCG是綠茶提取物中的主要多酚，被證明可以抑制LPS誘導小鼠腹膜巨噬細胞體外和體內(nèi)產(chǎn)生TNF-[12]。 EGCG抑制LPS誘導的TNF- mRNA 表達和核因子-kB（NF-kB）體外活性 [12，27]，表明存在可能的作用機制。此外，白藜蘆醇表現(xiàn)出抑制TNF-誘導的NF-kB的激活[28]，同時也顯著減弱 LPS 和佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯誘導的 COX-2 的表達[29]，并抑制NF-kB在小鼠皮膚和巨噬細胞中激活[30]。

我們發(fā)現(xiàn)通過口服強飼法給予小鼠OVW降低了經(jīng)LPS處理后小鼠TNF-的產(chǎn)生。TNF-產(chǎn)生的減少是與OVW劑量呈線性相關，OVW其ED50值為75 mg/小鼠 （3 g/kg）。由于TNF-也是導致類風濕性關節(jié)炎 （RA） 相關的炎癥發(fā)生的主要因素，我們想確定OVW是否可以與葡萄糖胺結合使用改善類風險關節(jié)炎中的相關炎癥發(fā)生，葡萄糖胺已被證明在類風濕性關節(jié)炎中可以促進關節(jié)健康、減少破壞并增加組織的重建。

氨基葡萄糖被認為通過促進關節(jié)基質(zhì)來保護關節(jié)免受炎癥和身體接觸引起的破壞，也被證明具有一定的抗炎活性。N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，被證明在人類關節(jié)軟骨細胞中可以抑制IL-1誘導的NO產(chǎn)生 [31]。抑制誘導型一氧化氮合酶mRNA和蛋白質(zhì)表達從而產(chǎn)生抑制作用。N-乙酰氨基葡萄糖，但非氨基葡萄糖，也抑制了IL-1誘導的COX-2和IL-6的產(chǎn)生。

文章首次證明了OVW和葡糖胺均可有效抑制經(jīng)LPS誘導的TNF-的產(chǎn)生的，以及OVW 與葡糖胺可協(xié)同抑制LPS誘導的細胞因子的產(chǎn)生。二者聯(lián)合的優(yōu)點包括通過降低目標療效所需的葡萄糖胺劑量來提高安全性，并降低潛在副作用。同時，即使在非常高的劑量下，OVW也沒有副作用 [32]。因此，OVW被證明是一種有效的節(jié)省劑量的化合物，不僅適用于氨基葡萄糖，而且適用于其他抗炎化合物和藥物。

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