基于高效液相色譜技術(shù)的本科創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)踐

胡鶯 孫姣霞 劉雪蓮 潘瑾

摘?要：依托教師科研項(xiàng)目，以典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A（Bisphenol?A，BPA）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，基于高效液相色譜技術(shù)設(shè)計(jì)并開展創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)，引導(dǎo)學(xué)生自主思考及實(shí)驗(yàn)探索，從分散液液微萃取前處理及高效液相色譜儀器分析兩大方面，摸索并優(yōu)化各項(xiàng)參數(shù)條件，建立高效、便捷的檢測(cè)方法用于定量分析水樣中BPA。創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合了新穎的科研內(nèi)容，激發(fā)學(xué)生主動(dòng)探索的興趣，不僅強(qiáng)化了學(xué)生的基本實(shí)驗(yàn)技能，而且培養(yǎng)和提升了學(xué)生的科研思維及綜合運(yùn)用知識(shí)的能力。

關(guān)鍵詞：創(chuàng)新實(shí)驗(yàn);實(shí)驗(yàn)教學(xué);高效液相色譜

2016?年召開的全國(guó)科技創(chuàng)新大會(huì)提出，我國(guó)要在2030?年進(jìn)入創(chuàng)新型國(guó)家前列，2050?年成為創(chuàng)新強(qiáng)國(guó)。實(shí)驗(yàn)室是高等學(xué)校實(shí)施素質(zhì)教育、培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新精神與實(shí)踐能力的重要基地[1]，但常規(guī)的學(xué)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)往往不能充分培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。在當(dāng)前國(guó)家大力推進(jìn)大眾創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的背景下，開設(shè)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是高校培養(yǎng)學(xué)生協(xié)作能力、科研能力、創(chuàng)新能力以及綜合素質(zhì)的重要環(huán)節(jié)[2]。同時(shí)，教學(xué)和科研相輔相成，基于科研過程和科研成果的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)更有助于激發(fā)學(xué)生對(duì)知識(shí)的探索欲，加深學(xué)生對(duì)專業(yè)學(xué)科領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)，強(qiáng)化學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)，提升學(xué)生的創(chuàng)新思維[3]。促進(jìn)科研與教學(xué)互動(dòng)，把科研成果轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，使實(shí)驗(yàn)教學(xué)從傳統(tǒng)的“知識(shí)傳授”轉(zhuǎn)變?yōu)椤爸R(shí)、能力、思維、素質(zhì)”綜合素質(zhì)培養(yǎng)，對(duì)推動(dòng)大學(xué)生參與科學(xué)研究、營(yíng)造良好的學(xué)術(shù)氛圍、培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神具有深遠(yuǎn)意義，具有廣闊的發(fā)展空間。

1?創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)背景及意義

合適的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)開展的重要基礎(chǔ)，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合新穎的科研內(nèi)容，教學(xué)內(nèi)容尚未涉及，具有一定的前瞻性，能引起學(xué)生主動(dòng)探索未知的興趣，并有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和綜合素質(zhì)，實(shí)現(xiàn)學(xué)生?“高分高能”的培養(yǎng)目標(biāo)[4]。

BPA在工業(yè)上常被用來合成環(huán)氧樹脂和聚碳酸醋等材料，從塑料袋、塑料飯盒、礦泉水瓶等日常用品，到醫(yī)療器械、食品包裝的內(nèi)襯等，生活中到處都有BPA的身影。BPA的大量生產(chǎn)和使用使它不斷轉(zhuǎn)移至環(huán)境，且大量研究已證明即便在極低劑量（ng/L）的存在下，BPA也能干擾人體及動(dòng)物正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而影響生殖功能，導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生等一系列嚴(yán)重?fù)p害，甚至具有遺傳效應(yīng)[5]。然而，在對(duì)環(huán)境樣品中痕量的?BPA?進(jìn)行分析的過程中，往往由于BPA的濃度較低甚至是微量、基質(zhì)組成復(fù)雜而被干擾，常規(guī)檢測(cè)方法達(dá)不到檢測(cè)要求。因此，高效、靈敏、便捷的檢測(cè)方法是開展BPA環(huán)境行為研究的基礎(chǔ)和保障，同時(shí)，環(huán)境樣品中BPA有效分離和富集的前處理至關(guān)重要。

分散液液微萃取（Dispersive??liquid-liquid??microextraction，DLLME）技術(shù)作為一種新型的樣品前處理手段，自Rezaee?等人于?2006?年首次提出以來迅速成為研究熱點(diǎn)[6]。Leong等在此基礎(chǔ)上建立了上浮溶劑固化分散液液微萃取技術(shù)（DLLME-SFO），采取低密度有機(jī)萃取劑，并在萃取離心后結(jié)合冷凍固化使萃取相凝固以方便移取。DLLME-SFO進(jìn)一步簡(jiǎn)化了操作，具有樣品需求量小、有機(jī)溶劑用量少、操作簡(jiǎn)便、萃取時(shí)間短、環(huán)境友好等突出[7]。本創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)結(jié)合分散液液微萃取上浮溶劑固化（DLLME-SFO）的樣品前處理方法和高效液相色譜法（HPLC）定量分析技術(shù)的聯(lián)用，指導(dǎo)學(xué)生全程參與實(shí)驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，設(shè)計(jì)并優(yōu)化樣品前處理及HPLC儀器分析的各項(xiàng)參數(shù)，建立快捷高效的水樣BPA檢測(cè)方法。教師全程指導(dǎo)，學(xué)生全程參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及開展，全方位培養(yǎng)學(xué)生的“知識(shí)、能力、思維、素質(zhì)”。同時(shí)，注重培養(yǎng)學(xué)生掌握文獻(xiàn)查閱和Word、Excel等文本編輯方法，以及SPSS、ORIGIN等數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件的使用，學(xué)習(xí)科研論文的基本組成和撰寫。

2?實(shí)驗(yàn)原理及核心內(nèi)容

本創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的核心內(nèi)容是從兩個(gè)方面進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化確定：其一是BPA定量分析的HPLC儀器檢測(cè)條件;另一方面是樣品的DLLME-SFO前處理?xiàng)l件。

基于環(huán)境介質(zhì)的復(fù)雜性以及環(huán)境樣品中BPA濃度通常較低的特點(diǎn)，通過樣品前處理需要達(dá)到分離和富集的目的，將BPA從樣品中分離出來并去除基體干擾，同時(shí)還要達(dá)到一定程度的富集效果以滿足后續(xù)定量檢測(cè)方法的檢出濃度。在進(jìn)行樣品中BPA檢測(cè)的DLLME-SFO前處理?xiàng)l件優(yōu)化時(shí)，主要通過富集倍數(shù)（Extraction?Factor，EF）和萃取回收率（Extraction?Recovery，ER）兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行萃取效果的考察和比較[8]，進(jìn)而確定優(yōu)化的萃取條件。

EF為上浮萃取相中BPA的濃度與水樣中BPA濃度的比值，Cfloated為萃取所得上浮相中BPA的濃度，C0為水樣中BPA的濃度。

萃取回收率ER（%）為萃取相中BPA的量占水樣中BPA量的百分比例，Mfloated為上浮萃取相中BPA的質(zhì)量，M0為水樣中BPA的質(zhì)量。Vfloated和V0分別為萃取相的體積和水樣體積。

樣品經(jīng)過DLLME-SFO前處理，其中的BPA分離富集至萃取相，并經(jīng)由離心冷凍后取出，所得到的萃取相融化后即可進(jìn)一步結(jié)合檢測(cè)儀器進(jìn)行定量分析。與氣相色譜（GC）和氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）等相比，高效液相色譜（HPLC）具有操作方便、測(cè)定時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)。在確定BPA檢測(cè)的HPLC色譜條件時(shí)，需重點(diǎn)考察并確定流動(dòng)相的種類及流量、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、進(jìn)樣量等參數(shù);并建立優(yōu)化條件下BPA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于BPA的定量分析。

最后，還需對(duì)實(shí)驗(yàn)所建立的DLLME-SFO-HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用逐步稀釋法結(jié)合高效液相色譜工作站，確定方法的檢出限和定量限。結(jié)合加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分析加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。從方法的線性范圍、檢出限、實(shí)際樣品加標(biāo)回收率等方面進(jìn)行所建檢測(cè)方法的綜合評(píng)價(jià)。