材料處理與切片方法對(duì)柑桔葉脈熒光顯微觀察的影響

牛 英，劉冰浩，范七君，陳傳武，婁兵海，蔣海蘭

(廣西柑桔育種與栽培工程技術(shù)研究中心/廣西特色作物研究院，廣西桂林,541004)

細(xì)胞是構(gòu)成植物體的基本單位，也是植物體生命活動(dòng)的基本單位，來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相同、彼此密切聯(lián)系的細(xì)胞群構(gòu)成功能組織[1]。植物組織細(xì)胞形態(tài)隨植物種類[2-4]、生長環(huán)境[5-7]、逆境脅迫[8-10]等不同而異，因此植物組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察是植物系統(tǒng)分類、遺傳演化、抗逆反應(yīng)等的主要研究方法之一。自然界中熒光現(xiàn)象極為普遍，許多物質(zhì)被短波譜線照射后發(fā)出熒光，這種現(xiàn)象稱為物質(zhì)的自發(fā)熒光現(xiàn)象；還有一些物質(zhì)只有和某種熒光物質(zhì)結(jié)合后才能激發(fā)出熒光，這種現(xiàn)象稱為物質(zhì)的誘發(fā)熒光現(xiàn)象[11]。熒光顯微技術(shù)是利用特定波長的光照射被檢物體產(chǎn)生熒光進(jìn)行檢測的顯微光學(xué)觀測技術(shù)。不同組織細(xì)胞理化性質(zhì)不同，在不同波長的照射下會(huì)產(chǎn)生不同顏色或不同強(qiáng)弱的熒光，使用熒光顯微鏡可以觀察到植物組織、細(xì)胞在普通光學(xué)顯微鏡下無法呈現(xiàn)的一些特征，有助于更有效地進(jìn)行觀察和鑒別[12-13]。

用于顯微觀察的切片方法一般為石蠟切片、冷凍切片和徒手切片3種。石蠟切片是顯微觀察的常規(guī)方法，但切片前的脫水、透明、滲蠟、包埋等處理過程復(fù)雜冗長[14-15]。冷凍切片不需要脫水、透明等步驟，具有快速、簡便、環(huán)保、易操作的特點(diǎn)[16-17]。與石蠟切片和冷凍切片相比，徒手切片顯微效果較差，但操作更為簡單，且不需要切片機(jī)等貴重儀器，可以很大程度上降低試驗(yàn)條件，提高工作效率，減少工作量[18-19]。用于顯微觀察的植物材料一般為新鮮材料和固定材料兩種，新鮮材料多用于徒手切片和冷凍切片；固定材料多用于石蠟切片，部分研究中也用于冷凍切片[20-21]。但不同的材料處理和切片方法是否對(duì)植物組織細(xì)胞的熒光顯微觀察產(chǎn)生影響尚未見系統(tǒng)報(bào)道。

因此，本研究以柑桔葉脈為材料，觀察、比較新鮮材料和FAA固定液固定材料在徒手切片和冷凍切片條件下，組織細(xì)胞自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光(苯胺藍(lán)染色)的顯微觀察特點(diǎn)，為柑桔及相似物種的組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)熒光顯微觀察提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 新鮮材料徒手切片熒光顯微觀察取當(dāng)年生沙糖桔成熟葉片主脈中段0.5 mm左右，用雙面剃須刀片橫切成若干薄片，分別用3種方法進(jìn)行熒光顯微觀察：(1)直接觀察，(2)用水浸潤后觀察；(3)0.1%苯胺藍(lán)染液染色5 min左右后觀察。

0.1%苯胺藍(lán)染液：稱取苯胺藍(lán)0.1g溶于100 mL 0.1 mol/L K3PO4溶液中，裝入棕色試劑瓶避光冷藏保存，下同。

熒光顯微觀察參數(shù)：顯微鏡(BX51，Olympus)，汞燈電源(BH2-RFL-T3，Olympus)，100 W高壓汞燈(USHIO USH-102D，Olympus)，數(shù)碼攝像頭(DP70，Olympus)，圖像采集軟件(Cellsens standard，Olympus)，紫外濾光片(NU，Olympus)，下同。

1.2 固定材料徒手切片熒光顯微觀察取當(dāng)年生沙糖桔成熟葉片主脈中段0.5 mm左右，用FAA固定液固定。固定好的材料，分別用50%乙醇、30%乙醇和蒸餾水各潤洗1次，每次30 min。處理好的材料用雙面剃須刀片橫切成若干薄片，切好的薄片分別用4種方法進(jìn)行熒光顯微觀察：(1)直接觀察；(2)0.1 mol/L K3PO4或1 mol/L NaOH浸潤5 min左右后觀察；(3)0.1%苯胺藍(lán)染液染色5 min左右后觀察；(4)10% Na2SO3沸水浴20 min軟化后，用0.1%苯胺藍(lán)染液染色5 min左右后觀察。

1.3 新鮮材料冷凍切片熒光顯微觀察取當(dāng)年生沙糖桔成熟葉片主脈中段0.5 mm左右，用徠卡CM1950冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片。得力液體膠為冷凍包埋劑，冷凍溫度為-11～-13 ℃，把材料包埋于自制的方形包埋盒內(nèi)0.5～2 h，待冷凍包埋劑充分凝固后開始切片，切片厚度6 μm，于載玻片上用水展片，晾干。晾干后的切片分別用2種方法進(jìn)行熒光顯微觀察：(1)直接觀察；(2)0.1%苯胺藍(lán)染液染色1 min左右后觀察。

1.4 固定材料冷凍切片熒光顯微觀察

取當(dāng)年生沙糖桔成熟葉片主脈中段0.5 mm左右，用FAA固定液固定。固定好的材料，分別用50%乙醇、30%乙醇和蒸餾水各潤洗1次，每次30 min；再用10%蔗糖溶液浸潤過夜。冷凍切片方法同“1.3”。切片分別用3種方法進(jìn)行熒光顯微觀察：(1)直接觀察；(2)0.1 mol/L K3PO4或1 mol/L NaOH浸潤1 min左右后觀察；(3)0.1%苯胺藍(lán)染液染色1 min左右后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮材料徒手切片熒光顯微觀察(1)直接觀察：葉主脈各組織細(xì)胞清晰可見；木質(zhì)部厚壁細(xì)胞呈較明亮的黃白綠色，韌皮部外圍厚壁纖維細(xì)胞呈灰藍(lán)色，韌皮部和皮層薄壁細(xì)胞呈淺的黃白綠色，表皮蠟質(zhì)層呈較亮的白綠色(圖1上)。此方法優(yōu)點(diǎn)是制片簡單，各組織細(xì)胞清晰可見；缺點(diǎn)是切片易失水收縮，需快速觀察拍照。

(2)水浸潤展片后觀察：木質(zhì)部、韌皮部外圍厚壁細(xì)胞熒光亮度增強(qiáng)，輪廓清晰；薄壁細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞熒光減弱，輪廊不清晰(圖1中)。此方法優(yōu)點(diǎn)是有較充足的觀察時(shí)間；缺點(diǎn)是切片在濕潤狀態(tài)下薄壁細(xì)胞壁輪廓較暗、不清晰，待切片干燥時(shí)同樣容易失水收縮。

(3)0.1%苯胺藍(lán)染液染色5 min左右后觀察：各組織熒光強(qiáng)度整體增強(qiáng)，薄壁細(xì)胞呈亮黃綠色，韌皮部外圍厚壁纖維細(xì)胞呈亮白藍(lán)色；韌皮部篩管分子胼胝質(zhì)沉淀呈白綠色亮點(diǎn)，但隨著苯胺藍(lán)溶液蒸發(fā)、切片變干時(shí)，胼胝質(zhì)呈現(xiàn)的亮白綠色熒光點(diǎn)逐漸變暗，甚至消失(圖1 下)。此方法優(yōu)點(diǎn)是各組織細(xì)胞輪廓更加明亮，有較充足的觀察時(shí)間；但切片較濕潤時(shí)，切片表面會(huì)產(chǎn)生氣泡，各組織輪廊不清晰，和方法(2)一樣需在切片自然干燥過程中尋找較佳的觀察狀態(tài)。

圖1 柑桔成熟葉片主脈中段新鮮材料徒手切片不同熒光顯微觀察方法比較

在條件允許的情況下，新鮮材料徒手切片熒光顯微觀察可以用來快速地觀測植物組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)育狀況，且效果良好。

2.2 固定材料徒手切片熒光顯微觀察(1)直接觀察：葉主脈各組織輪廓較清晰；木質(zhì)部、韌皮部外圍厚壁細(xì)胞呈藍(lán)色，清晰可見；其他組織細(xì)胞表面云霧狀，細(xì)胞壁輪廓不可見；切片上有不同程度的絮狀沉淀物遮擋(圖2 A1)。

(2)0.1 mol/L K3PO4或1 mol/L NaOH浸潤5 min左右后觀察：可有效溶解切片上的絮狀沉淀物，一定程度上提高切片的整體亮度，但不能改善整個(gè)切片的清晰度(圖2 A2-A3)。

(3)0.1%苯胺藍(lán)染液染色5 min左右后觀察：在去除切片上沉淀物的同時(shí)，整體提高切片的熒光亮度和木質(zhì)部、韌皮部外圍厚壁細(xì)胞的清晰度(圖2 A4)。

(4)10% Na2SO3沸水浴20 min軟化后用0.1%苯胺藍(lán)染液染色5 min左右后觀察：Na2SO3沸水浴軟化處理不能溶解切片表面沉淀物(圖2 B1)，苯胺藍(lán)染色后效果與不經(jīng)軟化的方法(3)基本一致，沒有明顯提高(圖2 B2)。

注：A1，直接觀察；A2，0.1 mol/L K3PO4浸潤后觀察；A3，1 mol/L NaOH 浸潤后觀察；A4，0.1%苯胺藍(lán)染液染色后觀察；B1，10% Na2SO3沸水浴后觀察；B2，10% Na2SO3沸水浴，0.1%苯胺藍(lán)染液染色后觀察。圖2 柑桔成熟葉片主脈中段FAA固定材料徒手切片不同熒光顯微觀察方法比較

固定材料徒手切片熒光顯微觀察不能細(xì)微觀測各組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，但可以用來觀測木質(zhì)部、纖維組織細(xì)胞及各組織的大小比例等發(fā)育狀況；與新鮮材料徒手切片相比，試驗(yàn)材料取材固定后，顯微觀測時(shí)間可以靈活安排。

2.3 新鮮材料冷凍切片熒光顯微觀察(1)直接觀察：葉主脈各組織細(xì)胞清晰可見；木質(zhì)部、韌皮部外圍厚壁細(xì)胞呈明亮的白藍(lán)色，韌皮部和皮層薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁呈稍暗的黃白綠色，表皮蠟質(zhì)層呈亮白色(圖3 A1-A2)。

(2)0.1%苯胺藍(lán)染液染色1 min左右后觀察：各組織熒光強(qiáng)度整體呈亮白綠色，韌皮部篩管分子胼胝質(zhì)沉淀呈白綠色亮點(diǎn)(圖3 B1-B2)；同新鮮材料徒手切片一樣，隨著苯胺藍(lán)染液蒸發(fā)，切片變干時(shí)，各組織整體呈亮白藍(lán)色，胼胝質(zhì)呈現(xiàn)的亮白綠色熒光點(diǎn)逐漸變暗、甚至消失(圖3 B3-B4)。

注：A1-A2，直接觀察；B1-B2，0.1%苯胺藍(lán)染液染色后濕潤狀態(tài)下觀察；B3-B4，0.1%苯胺藍(lán)染液染色后干燥狀態(tài)下觀察。圖3 柑桔成熟葉片主脈中段新鮮材料冷凍切片不同熒光顯微觀察方法比較

在條件允許的情況下，新鮮材料冷凍切片熒光顯微觀察可以用來觀測植物組織的細(xì)胞形態(tài)發(fā)育狀況，制好的切片可以在1周或者更長的時(shí)間進(jìn)行反復(fù)觀測。根據(jù)試驗(yàn)條件和試驗(yàn)要求，方法(1)和(2)可以靈活選用。

2.4 固定材料冷凍切片熒光顯微觀察(1)直接觀察：葉主脈各組織細(xì)胞清晰可見；同固定材料徒手切片一樣，切片上有不同程度的絮狀沉淀物；與新鮮材料冷凍切片基本一致，整體熒光亮度比新鮮材料稍暗；木質(zhì)部、韌皮部外圍厚壁細(xì)胞呈白藍(lán)色，皮層和韌皮部薄壁細(xì)胞呈稍暗的黃綠色(圖4 A)。

(2)0.1 mol/L K3PO4或1 mol/L NaOH浸潤1 min左右后觀察：可有效溶解切片上絮狀沉淀物，提高清晰度和完整度(圖4 B1-B2)。

(3)0.1%苯胺藍(lán)染液染色1 min左右后觀察：各組織熒光整體呈亮白綠色，韌皮部篩管分子胼胝質(zhì)沉淀呈白綠色亮點(diǎn)(圖4 C1)；同新鮮材料一樣，隨著苯胺藍(lán)染液蒸發(fā)，切片變干時(shí)，各組織熒光強(qiáng)度整體呈亮白藍(lán)色，胼胝質(zhì)呈現(xiàn)的亮白綠色熒光點(diǎn)逐漸變暗，切片徹底干燥后呈白色(圖4 C2-C3)。

注：A，直接觀察；B1-B2，0.1 mol/L K3PO4浸潤后觀察；C1，0.1%苯胺藍(lán)染液染色后濕潤狀態(tài)下觀察；>C2-C3，0.1%苯胺藍(lán)染液染色后干燥狀態(tài)下觀察。圖4 柑桔成熟葉片主脈中段FAA固定材料冷凍切片不同熒光顯微觀察方法比較

固定材料同新鮮材料的冷凍切片熒光顯微觀察效果基本一致，能細(xì)微觀測各組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，且試驗(yàn)材料固定后，顯微觀測時(shí)間可以靈活安排，但操作程序要比新鮮材料復(fù)雜。根據(jù)試驗(yàn)條件和試驗(yàn)要求，方法(2)和方法(3)可以靈活選用。

3 討論

細(xì)胞壁中的木質(zhì)、酚類化合物、角質(zhì)、栓質(zhì)、孢粉素等成分呈現(xiàn)自發(fā)熒光[11-22]。藏藥夏果貝的葉、莖熒光觀察顯示，木質(zhì)部和中柱鞘纖維顯明顯的熒光，而薄壁細(xì)胞和韌皮部基本不顯熒光，無需染色即可方便快捷地找到莖葉的木質(zhì)部和纖維群[13]；在黎族藥物大青莖粉末熒光顯微觀察中，晶纖維和木栓細(xì)胞明顯可見，結(jié)構(gòu)層次感強(qiáng)，不同纖維發(fā)出的熒光和亮度不一樣，可為鑒別不同種類的生藥提供重要的方法[23]。本研究中，柑桔葉脈木質(zhì)部和韌皮纖維的厚壁細(xì)胞及表皮細(xì)胞的蠟質(zhì)層自發(fā)熒光強(qiáng)烈，薄壁細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞熒光較弱，但也清晰可見。木質(zhì)素是植物細(xì)胞次生壁的主要成分之一，木質(zhì)部導(dǎo)管和韌皮纖維細(xì)胞為次生壁加厚的厚壁細(xì)胞，所以自發(fā)熒光強(qiáng)；而薄壁細(xì)胞次生壁薄，木質(zhì)素等次生物質(zhì)少，所以自發(fā)熒光弱。

在有機(jī)化合物中，能吸收光量子的化合物不是都能發(fā)射熒光的，但平常不能發(fā)射熒光的分子在特定條件下也可以發(fā)射熒光。pH值、溫度、激發(fā)光照射時(shí)間長短、熒光物質(zhì)的濃度和相態(tài)、淬滅劑的加入、觀察時(shí)間等都影響熒光的強(qiáng)弱和有無[11]。本研究中，柑桔組織細(xì)胞的自發(fā)熒光顏色和強(qiáng)度隨著處理方法的不同和切片濕潤度的不同而有不同程度的改變，切片變干后各組織細(xì)胞壁更為明亮，薄壁細(xì)胞形態(tài)更為清晰，但厚壁纖維細(xì)胞由于熒光過于強(qiáng)烈難以觀察細(xì)胞形態(tài)。韌皮部篩管分子細(xì)胞壁上的胼胝質(zhì)無自發(fā)熒光，經(jīng)苯胺藍(lán)染色后呈現(xiàn)的亮白綠色熒光點(diǎn)，在濕潤狀態(tài)下隨著觀察時(shí)間延長熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?，切片變干后熒光變?yōu)榘咨蛘呦?。因此，進(jìn)行熒光觀測時(shí)，要根據(jù)觀測對(duì)象，確定較佳的穩(wěn)定的觀測方法。

本研究中，在熒光顯微鏡下，新鮮材料的徒手切片可以清楚地看到細(xì)胞輪廓和組織結(jié)構(gòu)，固定材料的徒手切片雖然不能看清所有組織的細(xì)胞輪廓，但可以很好地區(qū)分表皮、皮層、韌皮纖維、韌皮部、木質(zhì)部、髓等基本的組織結(jié)構(gòu)；新鮮材料和固定材料的冷凍切片細(xì)胞輪廓更加清晰，組織結(jié)構(gòu)更加分明。然而，在普通光學(xué)顯微觀察條件下，徒手切片難以看清細(xì)胞輪廓和組織結(jié)構(gòu)；未經(jīng)染色的冷凍切片能清楚地看到細(xì)胞輪廓和組織結(jié)構(gòu)，但不同組織細(xì)胞間沒有色差，難以區(qū)分木質(zhì)部、韌皮部的厚壁細(xì)胞與薄壁細(xì)胞。與前人研究結(jié)果[13，23-24]一致，柑桔葉脈熒光顯微觀察同樣具有制片簡單、觀察視野潔凈、組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次感強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以根據(jù)不同的觀測需求，選擇不同的材料處理方式和切片方式。

本研究中發(fā)現(xiàn)，材料經(jīng)FAA固定后，切片上會(huì)出現(xiàn)沉淀物，導(dǎo)致難以進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的直接觀察，但經(jīng)0.1%苯胺藍(lán)染液染色后，切片上的沉淀消失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，固定材料經(jīng)苯胺藍(lán)染液中的K3PO4緩沖液或NaOH溶液處理后沉淀也會(huì)消失，但經(jīng)Na2SO3軟化處理后沉淀不消失。因此，用K3PO4溶液或NaOH溶液對(duì)固定材料進(jìn)行浸潤處理，可以很好的去除沉淀，達(dá)到較佳的觀測效果。此方法尚未見相關(guān)報(bào)道，可以為其他植物固定材料的顯微觀察提供借鑒。