miRNA-147靶向調(diào)控VEGF對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖和凋亡及遷移的影響

陳 方，李 恒，游 慧，邱煜焱，王 寧，陳 微

0引言

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是一種致盲性疾病，是導(dǎo)致孔源性視網(wǎng)膜脫離手術(shù)修復(fù)失敗的主要原因。一旦形成，PVR就很難治療。因此，開(kāi)發(fā)預(yù)防PVR的方法非常重要。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因是一種人體內(nèi)自然生成的細(xì)胞因子，目前已有研究表明抗VEGF治療可以減輕玻璃體的生物活性預(yù)防臨床PVR的形成[1]。

目前越來(lái)越多的研究表明人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞的增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與增殖膜的形成在PVR的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用[2-3]。miRNA是新發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)來(lái)影響機(jī)體功能的一類小分子非編碼RNA，已有證據(jù)表明，許多miRNA分子通過(guò)RPE增殖、遷移以及凋亡參與PVR的形成，如miRNA-146a和miR-194等[4-5]。miRNA-147是研究報(bào)道較多的一種小RNA，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[6-7]。但miRNA-147與PVR相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究前期生物信息學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)，VEGF可能是miRNA-147的靶基因。miRNA-147與VEGF在PVR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否具有調(diào)控作用，有待于進(jìn)一步探究。因此，以ARPE-19細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討了miRNA-147靶向調(diào)控VEGF對(duì)ARPE-19細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。

1材料和方法

1.1材料主要試劑：ARPE-19細(xì)胞系購(gòu)于上海佰曄生物科技中心。DAB顯色試劑盒、MTT試劑盒、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。野生型和突變型的VEGF 3’-UTR雙熒光報(bào)告質(zhì)粒購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司。DMEM、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。miRNA-147模擬物(ATCGTCTTCGTAAAGGCGTGTG)及其對(duì)照(AGTTCTTGCACGGAACGTACG)、VEGF抑制劑(GTCATGAAGTTCATGGATG)以及對(duì)照(GTGTGGATGAAAGTATGTC)、VEGF過(guò)表達(dá)(上游：5’-AAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3’；下游：5’-AAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3’)及空載體(上游：5’-TTTATCTCCGTCGGCCTTCT-3’；下游：5’-TTTCCTTTCTCCCCATCTTTG-3’)均由Biomics公司設(shè)計(jì)合成。兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體及HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染及分組將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ARPE-19細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)接種至6孔細(xì)胞板上，置于37℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取miRNA-147模擬物及其對(duì)照、VEGF抑制劑以及對(duì)照組、VEGF過(guò)表達(dá)及空載體，分別用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋至100nmol/L，每孔2mL含有脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(不處理)、無(wú)義miRNA組(轉(zhuǎn)染mimic NC)、miRNA-147模擬物組(轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物)、抑制劑陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染shRNA NC)、VEGF抑制劑組(轉(zhuǎn)染VEGF抑制劑)、miRNA-147模擬物+空載病毒載體組(miRNA-147模擬物和空載體)和miRNA-147模擬物+VEGF過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物和VEGF過(guò)表達(dá))。

1.2.2RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組miRNA-147和VEGFmRNA的表達(dá)收集各組轉(zhuǎn)染48h后的ARPE-19細(xì)胞，分別加入TRIzol提取RNA，再參照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測(cè)miRNA-147和VEGF mRNA的表達(dá)，以U6和GAPDH為內(nèi)參。miRNA-147正向：5’-GGGGTGTGTGGAAAT-3’，反向：5’-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’；U6正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。VEGF正向5’-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3’，反向：5’-CCTGGTGAGATCTGGTTC-3’；GAPDH正向：5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’，反向：5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’。RT-qPCR反應(yīng)程序和反應(yīng)體系參照說(shuō)明書(shū)。采用2-△△Ct的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.3熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miRNA-147和VEGF靶向關(guān)系將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞以每孔105個(gè)接種至12孔細(xì)胞板上，將WT-3’UTR、MUT-3’UTR與miRNA-147模擬物或無(wú)義miRNA共轉(zhuǎn)染至ARPE-19細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.4Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組VEGF蛋白的表達(dá)收集各組轉(zhuǎn)染48h后的ARPE-19細(xì)胞，分別加入RIPA裂解液并在冰上放置20min，4℃ 13 000r/min離心20min，采用BCA試劑盒測(cè)定上清的蛋白含量。取35μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)PVDF膜，用2%BSA封閉液封閉，分別加入一抗(1∶1 000)4℃過(guò)夜，以β-actin抗體(1∶10 000)為參照，再加入二抗(1∶10 000)室溫孵育1h。ECL曝光成像，采用Alpha Imager HP凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.5MTT實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，每孔加入終濃度為0.5mg/mL MTT。孵育4h后每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，放置酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)為570nm下測(cè)定吸光度OD值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液。各組取10萬(wàn)個(gè)的細(xì)胞加入195μL結(jié)合液和Annexin V-FITC 5μL，避光孵育10min，1 000r/min離心5min棄上清，再加入190μL結(jié)合液和10μL碘化丙啶染色液，低溫避光放置10min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取各組細(xì)胞加入孔板中，每孔背后含有5條橫線并含有5×105個(gè)細(xì)胞。過(guò)夜培養(yǎng)后，用200μL的槍頭垂直于背后的橫線劃痕，洗去劃下的細(xì)胞。處理24h后，取樣拍照。

2結(jié)果

2.1各組ARPE-19細(xì)胞miRNA-147表達(dá)水平比較空白對(duì)照組、無(wú)義miRNA組和miRNA-147模擬物組miRNA-147表達(dá)水平分別為：1.00±0.14、1.02±0.12、5.39±0.49，各組細(xì)胞miRNA-147表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=213.102，P<0.05)。與空白對(duì)照組和無(wú)義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組miRNA-147表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.919、17.838，均P<0.05)，提示ARPE-19細(xì)胞miRNA-147轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖1。

圖1 各組ARPE-19細(xì)胞miRNA-147表達(dá)水平比較 aP<0.05 vs 空白對(duì)照組；cP<0.05 vs 無(wú)義miRNA組。

2.2各組ARPE-19細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)水平比較各組細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.445，P<0.05)。與無(wú)義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組VEGF mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.980，P<0.05)；與抑制劑陰性對(duì)照組相比，VEGF抑制劑組VEGF mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.582，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過(guò)表達(dá)組VEGF mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.086，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組ARPE-19細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)比較

2.3各組ARPE-19細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平比較各組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=163.719，P<0.05)。與無(wú)義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.073，P<0.05)；與抑制劑陰性對(duì)照組相比，VEGF抑制劑組VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.577，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過(guò)表達(dá)組VEGF蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.100，P<0.05)，見(jiàn)表1、圖2。

圖2 各組ARPE-19細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平比較。

2.4雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-147與VEGF靶向關(guān)系雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-147和VEGF能夠靶向結(jié)合。miRNA-147模擬物能夠顯著抑制VEGF-WT報(bào)告載體的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.256，P<0.05)；而miRNA-147模擬物對(duì)VEGF-MUT報(bào)告載體的熒光素酶活性沒(méi)有明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.736，P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 miRNA-147靶向調(diào)控VEGF的表達(dá) aP<0.05 vs無(wú)義miRNA組。

2.5過(guò)表達(dá)miRNA-147或抑制VEGF對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖水平的影響48h后各組細(xì)胞增殖水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.267，P<0.05)。miRNA-147模擬物組細(xì)胞增殖水平與無(wú)義miRNA組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.920，P<0.05)；與抑制劑陰性對(duì)照組相比，VEGF抑制劑組增殖水平水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.728，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過(guò)表達(dá)組增殖水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.608，P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.6過(guò)表達(dá)miRNA-147或抑制VEGF對(duì)ARPE-19細(xì)胞凋亡水平及細(xì)胞周期的改變流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞數(shù)、S期和G2期細(xì)胞數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=128.468，F(xiàn)=140.761，F(xiàn)=24.485，F(xiàn)=25.736，均P<0.05)。與無(wú)義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增加；而S期、G2期細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.446、9.956、3.908、4.007，均P<0.05)；與抑制劑陰性對(duì)照組相比，VEGF抑制劑組細(xì)胞凋亡率及G0/G1期細(xì)胞數(shù)為明顯增加，而S期、G2期細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.279、15.089、9.298、4.810，均P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞數(shù)減少，而S期、G2期細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.174、19.731、4.815、9.455，均P<0.05)，見(jiàn)表2，圖4、5。

圖4 過(guò)表達(dá)miRNA-147或抑制VEGF對(duì)ARPE-19細(xì)胞凋亡水平的影響。

圖5 過(guò)表達(dá)miRNA-147或抑制VEGF對(duì)ARPE-19細(xì)胞周期的影響。

表2 各組ARPE-19細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期比例比較

2.7過(guò)表達(dá)miRNA-147或抑制VEGF對(duì)ARPE-19細(xì)胞遷移能力的影響各組細(xì)胞相對(duì)劃痕寬度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=188.141，P<0.05)。轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物或轉(zhuǎn)染VEGF抑制劑后細(xì)胞相對(duì)劃痕寬度與各自陰性對(duì)照組比較均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.388、12.732，均P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過(guò)表達(dá)組細(xì)胞相對(duì)劃痕寬度顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.961，P<0.05)，見(jiàn)表1、圖6。

圖6 過(guò)表達(dá)miRNA-147或抑制VEGF對(duì)ARPE-19細(xì)胞遷移能力的影響。

3討論

RPE細(xì)胞位于神經(jīng)視網(wǎng)膜光感受器的最外層，其功能異常、退化或死亡等通常會(huì)引起包括PVR在內(nèi)的多種嚴(yán)重視網(wǎng)膜疾病。值得一提的是，RPE細(xì)胞的增殖和遷移是PVR的形成的主要原因。目前研究表明在人類視網(wǎng)膜、角膜、晶狀體等眼部組織中已發(fā)現(xiàn)上百種miRNA表達(dá)，miRNA通過(guò)調(diào)控下游靶基因，維持眼部組織的正常功能[8]。近年來(lái)，miRNA與RPE細(xì)胞的關(guān)聯(lián)成為眼科的研究熱點(diǎn)。如Zhao等[9]研究表明miR-145可以抑制RPE細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡率。Wang等[10]研究表明miR-182通過(guò)靶向間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-Met)抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/分散因子(HGF/SF)誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞增殖和遷移增加，改善PVR及其引起的并發(fā)癥。Jun等[11]研究表明miR-124可能通過(guò)Ras同源家族成員G(RHOG)抑制RPE細(xì)胞增殖和遷移，減輕視網(wǎng)膜疾病中纖維血管增生。這提示miRNA可通過(guò)抑制RPE細(xì)胞的增殖和遷移作為預(yù)防PVR疾病發(fā)生的靶點(diǎn)。

如今關(guān)于miRNA-147的研究大多是關(guān)于各類腫瘤細(xì)胞，經(jīng)證實(shí)，miRNA-147過(guò)表達(dá)抑制乳腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮抑癌作用，而促進(jìn)食道癌細(xì)胞增殖發(fā)揮致癌作用[7,12-14]。由此可知，miRNA-147在不同的癌組織中發(fā)揮著完全不同的作用。除此之外，Sui等[15]研究表明MicroRNA-147通過(guò)抑制同源盒蛋白C6(HOXC6)抑制人肝細(xì)胞癌增殖遷移。由此推測(cè)miRNA-147有可能參與RPE細(xì)胞增殖和遷移。本研究通過(guò)脂質(zhì)體法向RPE細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物后RPE細(xì)胞凋亡水平顯著增加、而細(xì)胞增殖和遷移能力降低。這與推測(cè)結(jié)論一致，提示miRNA-147在RPE細(xì)胞增殖、凋亡和遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，miRNA-147可通過(guò)抑制RPE細(xì)胞的增殖和遷移作為抑制PVR疾病發(fā)展的靶點(diǎn)之一，但其具體的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

VEGF是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種與血管增殖有關(guān)的生長(zhǎng)因子，基因位于6號(hào)染色體的P12～P21區(qū)域，8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，轉(zhuǎn)錄時(shí)可剪接成VEGF121、VEGF165、VEGF145、VEGF206、VEGF189 5種異構(gòu)體[16]。VEGF在含有血管結(jié)構(gòu)如結(jié)膜、虹膜、脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜的正常眼組織中表達(dá)較低，VEGF與VEGF受體(VEGFRs)結(jié)合參與視網(wǎng)膜血管形成，并維持血管內(nèi)皮細(xì)胞活性[17]。VEGF水平升高是許多眼部血管疾病已知的主要原因之一，同時(shí)，抗VEGF療法已被常規(guī)應(yīng)用于治療眼血管疾病。Pennock等[1]研究表明VEGF主要通過(guò)間接激活血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子受體的活性，促進(jìn)玻璃體視網(wǎng)膜病變的增殖，且在兔玻璃體內(nèi)注射VEGF抑制劑可以預(yù)防PVR發(fā)生。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染VEGF抑制劑可抑制RPE細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這與雷祥等[18]研究結(jié)果一致，其研究結(jié)果表明丹參酮ⅡA在缺氧條件下通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)抑制RPE細(xì)胞增殖，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA可影響VEGF信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。陳云霞等[19]研究表明，miR-27可能通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝、VEGF過(guò)程介導(dǎo)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病及進(jìn)展。本研究在Targetscan數(shù)據(jù)查詢發(fā)現(xiàn)，VEGF 3’-UTR中存在miRNA-147的目標(biāo)堿基序列，且RT-qPCR和Western blot分析結(jié)果顯示，VEGF在miRNA-147模擬物轉(zhuǎn)染后下調(diào)，由此我們推測(cè)miRNA-147對(duì)VEGF有靶向調(diào)控作用。此外，本研究通過(guò)單獨(dú)抑制VEGF基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)VEGF抑制RPE細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；過(guò)表達(dá)VEGF可逆轉(zhuǎn)miRNA-147模擬物對(duì)RPE細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的抑制作用，提示miRNA-147通過(guò)靶向VEGF抑制RPE細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)PVR的進(jìn)展發(fā)揮重要作用。這與Hu等[20]和Linetsky等[21]研究結(jié)果一致。

綜上所述，miRNA-147在RPE細(xì)胞增殖、凋亡和遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其作用機(jī)制可能與靶向抑制VEGF表達(dá)有關(guān)，提示miRNA-147有望成為預(yù)防PVR新靶點(diǎn)。