電針聯(lián)合膈下逐瘀湯對輸卵管炎性不孕大鼠TLR4、NF-κB水平的影響

胡喜姣，李紅梅，楊東霞，李蘭，孫萌，劉麗

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

不孕癥指女性無避孕，性生活至少12個月而未孕。近年來，不孕癥發(fā)病率逐年上升并趨于年輕化，輸卵管性病因占不孕癥首要因素[1]。輸卵管炎性不孕是指因輸卵管管腔阻塞、拾卵及蠕動異常等輸卵管結(jié)構與功能的損傷引起的妊娠障礙。中醫(yī)學認為，“瘀”為本病主要病機，治療藥物應以活血化瘀為主[2]。膈下逐瘀湯為氣滯血瘀證的代表方劑，源于清代王清任《醫(yī)林改錯》。吾師劉麗教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，治療輸卵管性不孕癥，在此方基礎上加減運用，療效確切[3]。

“一針二灸三吃藥”，電針治療輸卵管炎性不孕癥取得良好療效。已有臨床研究表明，針刺關元、大赫、三陰交、次髎、秩邊穴位，能夠降低輸卵管腫瘤壞死因子-α和血清白細胞介素-6水平[4]。課題組前期臨床研究表明，針藥聯(lián)合治療有利于提高輸卵管炎性不孕癥患者輸卵管復通率及受孕率[5]。本研究在此基礎上，設立電針聯(lián)合中藥治療組，與單純中藥治療組相比較，重點突出電針及針藥聯(lián)合治療輸卵管炎性不孕癥的機制及價值，支持臨床推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康SPF級SD大鼠48只，雌性，周齡8～10周，體質(zhì)量(200±20)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證編號：SCXK(黑)2019-007。環(huán)境溫度保持在22 ℃，相對濕度維持40%，光暗周期12 h，分籠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，適應性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 主要藥物及試劑

膈下逐瘀湯(GD)：當歸、川芎、桃仁、五靈脂、丹皮、赤芍、烏藥、延胡索、甘草、香附、紅花、枳殼(以上中草藥均購于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院飲片藥局)；金黃色葡萄球菌(北京東方賽瑞生物技術有限公司，ATCC29213)；Toll樣受體4(TLR4)兔多克隆抗體(武漢三鷹生物，19811-1-AP)；核因子-κBp65(NF-κBp65)兔抗鼠多克隆杭體(武漢三鷹生物，10745-1-AP)；氯化鈉注射液(吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司)；水合氯醛、烏拉坦(上海山浦化工有限公司)；二甲苯(天津市永大化學試劑有限公司)；無水乙醇(天津市永大化學試劑有限公司)。

1.2 分組及造模方法

1.2.1 分組方法

48只雌性SD大鼠，隨機分為4組，每組12只，分別為正常組、模型組、治療組、對照組。正常組不給予任何手術操作及藥物；模型組行金黃色葡萄球菌輸卵管局部注射造模后，給予等體積蒸餾水；治療組同等方法造模后，給予電針及中藥治療；對照組同等方法造模后，給予單純中藥治療。

1.2.2 造模方法

將10%水合氯醛按照0.4 mL/100 g劑量對大鼠進行腹腔注射麻醉，待麻醉顯效后，取俯臥位，大鼠背部兩側(cè)腎區(qū)先行備皮，碘伏消毒，鋪無菌巾，取肋緣過腎區(qū)近脊柱側(cè)約0.5 cm，行長約1 cm橫切口，逐層打開腹腔，充分暴露單側(cè)子宮及輸卵管、卵巢，向輸卵管—卵巢方向注入4×109/mL金黃色葡萄球菌懸液0.1 mL，注菌過程中防止菌液逆流并避免機械性損傷，術畢逐層關腹，碘伏再次消毒切口。同種方法處理對側(cè)輸卵管。

1.3 藥品制備及干預方法

1.3.1 膈下逐瘀湯制備方法

當歸9 g，川芎6 g，桃仁9 g，五靈脂6 g(包煎)，牡丹皮6 g，赤芍6 g，烏藥6 g，延胡索3 g，甘草9 g，香附5 g，紅花9 g，枳殼5 g以上飲片，五靈脂紗布包好，按比例水煎煮，一煎10倍量水，二煎8倍量水，加熱回流提取各2 h，合并兩煎藥液，水煎液濃縮適當濃度移至蒸發(fā)皿中，最后移至真空干燥箱中干燥至衡重，得膈下逐瘀水煎液干粉。

1.3.2 干預方法

經(jīng)輸卵管注射金黃色葡萄球菌，可在術后第28 d形成輸卵管炎性不孕癥模型[6]。故于實驗第29 d開始給藥，治療組給予電針及膈下逐瘀湯口服。首先將大鼠固定鼠套中，參照《實驗針灸學》選穴：三陰交、關元、足三里。局部消毒后，直刺進針，深度為2～7 mm，得氣后，針柄接電針儀，電流強度1 mA，連續(xù)波頻率2 Hz，強度保持肌肉微振為宜，留針20 min，每日1次。并于每日9時給予膈下逐瘀湯水煎液濃縮干粉，加水制成相當于0.36 g/mL的混懸液。對照組大鼠每日9時給予等同濃度的膈下逐瘀湯混懸液，灌胃劑量按照2 mL·100 g-1鼠重給藥。模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)治療4周。正常組不給藥。

1.4 檢測方法

1.4.1 肉眼觀察輸卵管形態(tài)及評分

給藥第29 d，各組大鼠腹腔麻醉(方法同前)后，無菌條件下解剖大鼠，充分暴露輸卵管，肉眼觀察大鼠輸卵管病變情況，注意有無扭曲、積水及與周圍組織粘連等情況，具體評分標準詳見表1。

表1 輸卵管組織形態(tài)評分標準

1.4.2 光鏡觀察輸卵管病理學情況

將大鼠輸卵管組織制成3 μm厚度的切片，進行HE染色，制成病理切片，光鏡下觀察各組大鼠輸卵管形態(tài)學改變情況。

1.4.3 免疫組化檢測輸卵管TLR4及NF-κB表達

將各組大鼠輸卵管行免疫組化檢測，取新鮮組織固定于4%多聚甲醛24 h后。修整目的部位組織，對應標簽置于脫水盒。經(jīng)脫水、包埋后切片,按4 μm切片,取石蠟切片進行蘇木素染色，返藍。脫水后中性樹膠封片，顯微鏡觀察圖像。

免疫組化圖像分析：采用平均光密度值，在光密度值基礎上計算平均光密度值，即指整個視野中第一點的光密度疊加點數(shù)的總和，公式：OD=∑A/N。光密度值根據(jù)光吸收定量換算而來：A=Log[I0(x,y)/I(x,y)]=K(x,y)C(x,y)L(x,y)(A代表吸光度，I0代表出射光強度，I代表入射光強度，K代表吸光系數(shù)，C和L代表被測物濃度和厚度(S,Y)代表素點位置)。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 實驗結(jié)果

2.1 肉眼觀察針藥聯(lián)合對大鼠輸卵管組織形態(tài)評分影響

正常組大鼠輸卵管均呈粉紅色，外觀表面光滑，輸卵管管腔內(nèi)無積水、無積膿，與周圍組織無明顯粘連。與正常組比較，模型組大鼠輸卵管均出現(xiàn)不同程度的輸卵管管壁增厚、腫脹及盆腔粘連情況；與模型組相比，治療組與對照組大鼠輸卵管管壁增厚、腫脹及盆腔粘連例數(shù)均有所減少，程度有所減輕，均能不同程度改善輸卵管形態(tài)及盆腔粘連情況。與對照組相比，治療組作用更為明顯。見表2。

表2 肉眼觀察各組大鼠輸卵管形態(tài)情況(n=12)

各組大鼠輸卵管形態(tài)評分情況，與正常組相比，模型組總分升高極為顯著(P<0.01)；與模型組相比，治療組與對照組總分下降顯著(P<0.05)；與對照組相比，治療組總分下降顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠輸卵管形態(tài)評分情況

2.2 HE染色觀察針藥聯(lián)合對大鼠輸卵管病理學影響

與正常組相比，模型組大鼠輸卵管細胞排列較紊亂，胞體腫脹，大部分細胞核腫脹，細胞粘連充血；治療組輸卵管管腔上皮輕度脫落，輸卵管周圍可見少量炎細胞；對照組輸卵管管腔大量炎細胞，上皮細胞脫落，部分壞死，輸卵管周圍可見較多炎細胞，胞體腫脹明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠輸卵管HE染色情況(×400)

2.3 針藥聯(lián)合對大鼠輸卵管TLR4和NF-κB蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組TLR4和NF-κB水平有十分顯著的上升(P<0.01)，表明慢性輸卵管炎癥模型的構建成功；與模型組比較，治療組可使TLR4和NF-κB含量出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)；對照組可使TLR4含量下調(diào)，對NF-κB含量影響并不明顯；與對照組相比，治療組在下調(diào)TLR4和NF-κB水平上作用更加明顯。見表4，圖2～3。

表4 各組大鼠輸卵管中TLR4和NF-κB表達情況

圖2 各組大鼠輸卵管TLR4表達情況(×400)

圖3 各組大鼠輸卵管NF-κB表達情況(×400)

3 討論

不孕癥一直以來是困擾育齡夫婦的難題，中醫(yī)藥對于不孕癥的治療有獨特的優(yōu)勢。電針具有改善人體循環(huán)，促進炎癥吸收，活血化瘀功效。關元，位于大鼠臍下約25 mm處?！肚Ы鹨健分杏涊d:“婦人絕嗣不生……灸關元三十壯，報之”，關元為陰中之陽，可治婦人不孕。有研究表明，關元具有抑制微炎癥作用[7]。足三里(后三里)，位于大鼠膝關節(jié)后外側(cè)，在腓骨下頭約5 mm處。具有補益精血之功，為強壯保健要穴。正所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”，故本研究選用此穴，提高療效。三陰交，后肢內(nèi)踝尖直上10 mm處。三陰交為足三陰經(jīng)交會穴，與胞宮關系密切，是治療婦科病要穴，電針三陰交可活血調(diào)經(jīng)、通調(diào)氣血，通過改善子宮微循環(huán)、加快子宮血流而起到鎮(zhèn)痛作用[8]。

膈下逐瘀湯中枳殼、香附、延胡索、烏藥行氣活血止痛，紅花、桃仁、赤芍、五靈脂、丹皮活血祛瘀止痛；川芎、當歸活血養(yǎng)血調(diào)經(jīng)；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏行氣活血、祛瘀行滯之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，枳殼、香附中含有揮發(fā)油、黃酮類成分，具有抗菌抗病毒、抗炎功效[9-10]；延胡索、烏藥均具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌功效[11-12]；紅花為傳統(tǒng)的活血化瘀藥，常與桃仁配伍，桃仁中的桃仁蛋白能夠明顯抑制炎癥引起的血管通透性，具有抗炎作用[13]。牡丹皮中的丹皮酚能夠殺金葡菌[14]，調(diào)節(jié)NF-κB水平[15]。當歸補血活血為“婦科要藥”[16]，具有顯著抗炎功效[17]。川芎為“血中之氣藥”，與當歸配伍行氣活血，利于化瘀疏通。甘草應用廣泛，有“十方九草”之稱，有研究表明，甘草具有較強的抗炎功效[18]。

Toll樣受體4(TLR4)信號通路是重要的炎性通路之一。TLR4在正常輸卵管中表達強度較低，在輸卵管炎的發(fā)生中起著重要作用，表達強度較高[19]。FazeliA等[20]證實TLR4與生殖系統(tǒng)的免疫有關。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是誘導單核巨噬細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子的重要轉(zhuǎn)錄因子[21]。當輸卵管黏膜受到病原微生物的反復或大量入侵時，機體的固有免疫機制被激活，TLR4在識別病原相關分子模式后，引發(fā)級聯(lián)反應，使單核巨噬細胞產(chǎn)生大量的促炎細胞因子，通過其細胞毒作用及促炎因子間的協(xié)同作用，導致輸卵管炎的發(fā)生和輸卵管黏膜上皮細胞的破壞。

本研究表明，電針聯(lián)合膈下逐瘀湯能夠明顯改善輸卵管炎性不孕大鼠的輸卵管形態(tài)，下調(diào)TLR4及NF-κB的表達水平，效果優(yōu)于單純膈下逐瘀湯治療。電針疏通經(jīng)絡，改善微循環(huán)；膈下逐瘀湯行氣活血，化瘀通絡；二者聯(lián)合應用，體現(xiàn)從“瘀”論治不孕癥，療效顯著。目前臨床上，氣滯血瘀型不孕癥為常見分型，治療中亦多采用針藥聯(lián)合治療，本實驗結(jié)果支持臨床推廣應用。