TGF-β1受體ALK1和ALK5在翼狀胬肉和正常結(jié)膜組織中的差異表達(dá)

張 燦，王 賀，陳冬燕，趙 凱，李明新

0引言

翼狀胬肉是角膜表面一種良性進(jìn)展性生長(zhǎng)的纖維血管組織。翼狀胬肉的主要癥狀為異物感、眼紅和視力模糊，并可導(dǎo)致不規(guī)則散光，如果不加以治療，最終會(huì)遮擋視軸區(qū)角膜引起視力喪失。研究顯示翼狀胬肉的流行病學(xué)在不同的國(guó)家和地區(qū)是不同的，澳大利亞的發(fā)病率最低，為3%[1]，而中國(guó)白族地區(qū)的翼狀胬肉發(fā)病率最高，為30%[2]。目前手術(shù)切除是治療翼狀胬肉的主要方法，單純切除復(fù)發(fā)率較高，往往聯(lián)合結(jié)膜瓣移植、羊膜移植或應(yīng)用抗代謝藥物。翼狀胬肉的確切病因尚不清楚，據(jù)推測(cè)，角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells, LSCs)的損傷可能是主要的發(fā)病因素，上皮向基質(zhì)的轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)可能在胬肉的生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(transforming growth factor beta-1, TGF-β1)是一種細(xì)胞因子，參與多種不同器官的疾病進(jìn)程，如腎臟、肝臟、肺、皮膚、心臟或血管[4]。經(jīng)典的TGF-β1信號(hào)通路需要與TGF-βⅡ型受體(TβRII)結(jié)合，隨后招募具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的TGF-βⅠ型受體(TβRI)，它磷酸化成為Smads蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)，Smads作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核激活或抑制特定基因的表達(dá)。在不同的TβRI中，起主要作用的是激活素受體樣激酶1(activin receptor-like kinase 1, ALK1)和激活素受體樣激酶5(activin receptor-like kinase 5, ALK5)。

TGF-β信號(hào)通路在腫瘤增殖遷移、癲癇、肝腎纖維化的進(jìn)程中已經(jīng)得到充分的研究，且有證據(jù)表明，ALK1與ALK5兩種受體激活不同的信號(hào)通路，在組織器官的病理改變中互為拮抗、互相調(diào)節(jié)[5]。已有報(bào)道與正常結(jié)膜相比，胬肉組織高表達(dá)TGF-β1[6]，然而TGF-β1相關(guān)受體的研究在國(guó)內(nèi)外報(bào)道均較少。本研究采用免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR和Western Blot來研究ALK1、ALK5在胬肉組織和正常結(jié)膜組織中的表達(dá)，旨在探討TGF-β1相關(guān)信號(hào)通路在翼狀胬肉發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，為指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象前瞻性研究。本研究選取2020-06/12在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科就診的翼狀胬肉患者進(jìn)行研究，本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.XYFY2020-KL033-01)，并于中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心注冊(cè)(No.ChiCTR1900027108)，所有患者簽署知情同意書。試驗(yàn)組為40例(女23例，男17例，年齡39～82歲)經(jīng)手術(shù)切除的翼狀胬肉標(biāo)本，試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)原發(fā)性翼狀胬肉；(2)胬肉頭端侵入角膜緣內(nèi)側(cè)的長(zhǎng)度≥2mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他眼表疾??；(2)眼部手術(shù)、外傷史；(3)近期持續(xù)局部或全身用藥；(4)大翼狀胬肉(超過角膜直徑的1/3)；(5)假性翼狀胬肉。對(duì)照組為40例(女21例，男19例,年齡44～82歲)白內(nèi)障手術(shù)中獲取的正常球結(jié)膜標(biāo)本，對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合白內(nèi)障摘除術(shù)手術(shù)指征；(2)首診白內(nèi)障；(3)年齡相關(guān)性白內(nèi)障。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)眼部(內(nèi)眼)手術(shù)史、外傷史；(2)眼表、青光眼、眼底疾病等其他眼部病史；(3)自身免疫性疾病史、結(jié)締組織病史、內(nèi)分泌疾病史。兩組間性別、年齡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在每組的40例標(biāo)本中，隨機(jī)數(shù)字表法選取30例用于ALK1、ALK5免疫組化染色，5例用于RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)，5例用于Western Blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

1.2方法

1.2.1組織病理學(xué)和免疫組化評(píng)估對(duì)翼狀胬肉頭部和正常結(jié)膜組織進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)和免疫組化檢測(cè)。所有獲得的組織置于4%多聚甲醛中4℃固定過夜，自動(dòng)石蠟包埋機(jī)包埋，隨后行組織切片。免疫組化染色方法如下：(1)將石蠟包埋過后的組織切片置60℃烘干箱3h，之后置二甲苯溶液脫蠟；(2)梯度酒精洗去二甲苯及水化；(3)用HRP阻斷液室溫孵育1h，去除內(nèi)源性過氧化物酶活性；(4)滴加用1%BSA配制的一抗：兔抗人ALK1(濃度1∶400，ab68703，英國(guó)abcam公司)或兔抗人ALK5(濃度1∶400，ab31013，英國(guó)abcam公司)，4℃搖床孵育過夜；(5)滴加過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(預(yù)配制，12-348，美國(guó)Sigma公司)，4℃孵育 2h；(6)使用DAB顯色液加至標(biāo)本上，顯色6min；(7)Hoechst(1∶500)染細(xì)胞核，1∶1甘油/1×PBS封片；(8)顯微鏡下觀察照相。以上已略去各步驟間PBS清洗過程。染色結(jié)果以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒作為陽性表達(dá),切片在光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野,計(jì)算陽性率,即5個(gè)高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比率并取平均值。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)組織中ALK1、ALK5mRNA的表達(dá)使用TRIzol RNA提取液抽提胬肉或結(jié)膜組織總RNA，使用DNase試劑盒清除殘留的DNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用ALK1、ALK5引物擴(kuò)增相應(yīng)基因，ALK1上游引物為 5’-AATCGCACCAAGTAGAGCCC-3’，下游引物為5’-GAGGGAAAGACCAGTGGACG-3’，ALK5上游引物為5’-TGGGCTCTGCTTTGTCTCTG-3’，下游引物為5’-TGTGAAGATGGGCAAGACCG-3’；β-actin上游引物為5’-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’，下游引物為5’-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3’。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，EB染色，凝膠成像儀拍照。使用Image J軟件分析其條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3WesternBlot檢測(cè)組織中ALK1、ALK5蛋白的表達(dá)手術(shù)中獲取的胬肉和結(jié)膜樣本置于細(xì)胞裂解液中，勻漿機(jī)打碎使其充分裂解，離心取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白總量。取胬肉和正常結(jié)膜樣本各15μg，按4∶1加入上樣緩沖液，100℃變性3min。在4℃、非還原狀態(tài)下行質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE 120V電泳2h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上110mA作用2h，封閉液(1×TBS 50.00mL，Tween 0.25mL，脫脂奶粉2.5g)室溫下封閉硝酸纖維素濾膜的非特異性免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)1h，將濾膜與兔抗人ALK1或ALK5單克隆抗體一抗(1∶800稀釋于封閉液)孵育，4℃振搖過夜，TBST緩沖液(10×TBS 15.00mL，蒸餾水135.00mL，Tween 0.15mL)沖洗濾膜3次，將濾膜轉(zhuǎn)移至HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶800稀釋于封閉液)中室溫孵育1h。TBST緩沖液再次沖洗濾膜，用ECL發(fā)光試劑與硝酸纖維素膜作用3min，在暗室內(nèi)曝光，X射線顯影。所得條帶經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析得到的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

ALK1免疫組化結(jié)果顯示(圖1)：在所有檢測(cè)的標(biāo)本中，正常結(jié)膜組ALK1陽性的細(xì)胞主要位于結(jié)膜上皮基底層，以細(xì)胞核深染為主，少量細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿著染，淺表上皮亦有少量ALK1染色陽性的細(xì)胞，結(jié)膜基質(zhì)層未見AKL1表達(dá)，在所有層次中，ALK1陽性細(xì)胞比率為(5.35±1.75)%。翼狀胬肉組織標(biāo)本可見幾乎所有的上皮細(xì)胞均為ALK1表達(dá)陽性，且主要表現(xiàn)為胞漿著染，基質(zhì)層亦未見ALK1表達(dá)，ALK1陽性細(xì)胞比率為(12.42±4.64)%，與對(duì)照組相比，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.244,P<0.05)。

圖1 使用免疫組化檢測(cè)ALK1在正常結(jié)膜組織和翼狀胬肉組織中的表達(dá) A、B：ALK1表達(dá)于正常結(jié)膜組織的上皮細(xì)胞基底層,以細(xì)胞核深染為主，少量細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿著染；C、D：翼狀胬肉組織標(biāo)本可見幾乎所有的上皮細(xì)胞均為ALK1表達(dá)陽性，且主要為胞漿著染。

ALK5免疫組化結(jié)果顯示(圖2)：正常結(jié)膜組ALK5主要表達(dá)于結(jié)膜上皮基底層，與ALK1的表達(dá)模式相似，但未見胞漿著染，淺表上皮細(xì)胞和基質(zhì)層細(xì)胞未見ALK5表達(dá)陽性細(xì)胞，ALK5陽性細(xì)胞比率為(4.27±1.35)%。與對(duì)照組相比，翼狀胬肉上皮基底層僅見少量細(xì)胞表達(dá)ALK5，陽性細(xì)胞比率為(1.55±0.86)%，與對(duì)照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.159,P<0.05)。

圖2 使用免疫組化檢測(cè)ALK5在正常結(jié)膜組織和翼狀胬肉組織中的表達(dá) A、B：ALK5主要表達(dá)于正常結(jié)膜組織的上皮細(xì)胞基底層,以細(xì)胞核深染為主；C、D：翼狀胬肉上皮基底層僅見少量細(xì)胞表達(dá)ALK5。

RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示(圖3)：正常結(jié)膜組ALK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.2±0.1，翼狀胬肉組ALK1 mRNA的表達(dá)明顯增加，相對(duì)表達(dá)量為1.3±0.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.186,P<0.05)；與之相比，翼狀胬肉組ALK5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.15±0.08)顯著低于正常結(jié)膜組(0.6±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.833,P<0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR基本一致，ALK1在正常結(jié)膜組和翼狀胬肉組的相對(duì)表達(dá)量分別為0.4±0.1和0.8±0.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.327,P<0.05)；ALK5的蛋白相對(duì)表達(dá)量由正常結(jié)膜組的0.35±0.13下降為0.05±0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.722,P<0.05)。

圖3 RT-PCR及Western Blot檢測(cè)ALK1、ALK5mRNA、蛋白在結(jié)膜和胬肉組織中的表達(dá)(n=5) A：兩組ALK1、ALK5 mRNA表達(dá)電泳圖；B：兩組間ALK1、ALK5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較;C：兩組ALK1、ALK5 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果；D：兩組間ALK1、ALK5 蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異。aP<0.05 vs 對(duì)照組。

3討論

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，病變首先是角膜緣上皮細(xì)胞的向心性生長(zhǎng)，隨后出現(xiàn)以成纖維細(xì)胞活化為特征的鱗狀上皮化生，伴有新生血管生長(zhǎng)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞外基質(zhì)重塑。翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制尚未明確，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖和凋亡、EMT都可能參與了翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展過程[7]。根據(jù)翼狀胬肉的生長(zhǎng)傾向，有研究表明翼狀胬肉可能是一種增生性疾病，不過這種增生受到機(jī)體精確的調(diào)控，使其不能像腫瘤組織一樣無限制的生長(zhǎng)[8]。在這種調(diào)控過程中，TGF-β1信號(hào)通路誘導(dǎo)的EMT、肌成纖維細(xì)胞的激活可能起到關(guān)鍵作用。TGF-β1可以通過其受體控制一系列轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)EMT，這些轉(zhuǎn)錄因子抑制上皮細(xì)胞表型(細(xì)胞連接和極性復(fù)合物成分)的表達(dá)，并增強(qiáng)間充質(zhì)細(xì)胞表型(基質(zhì)金屬蛋白酶，纖維黏連蛋白、波形蛋白)的表達(dá)[9]。

TGF-β1信號(hào)通路在眼部的發(fā)育、損傷修復(fù)和新生血管形成中發(fā)揮著重要的作用，李曉文等[10]發(fā)現(xiàn)TGF-β1可促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮層細(xì)胞的增殖、遷移和向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并能激活細(xì)胞內(nèi)的ALK5、VEGF等信號(hào)分子；而在角膜感染或外傷的病理改變中，TGF-β1信號(hào)通路也參與調(diào)控著炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞活化、角膜瘢痕形成等各個(gè)過程[11]。Wilson等[12]觀察到TGF-β信號(hào)通路相關(guān)分子在翼狀胬肉中的表達(dá)，在角膜緣基質(zhì)中有TGF-β1的表達(dá)，在中央和周圍角膜中TGF-β2和β3的表達(dá)。正常結(jié)膜組織TGF-β的表達(dá)比翼狀胬肉組織弱得多，在三種TGF-β亞型中，TGF-β1在體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中過表達(dá)[9]，羊膜可抑制TGF-β受體以及培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中TGF-β mRNA的表達(dá)[13]，盡管這些研究表明TGF-β本身在翼狀胬肉的纖維血管生長(zhǎng)中很重要，但三種TGF-β及其受體在翼狀胬肉中的表達(dá)和作用模式尚未完全確定。

ALK是一類絲氨酸-蘇氨酸激酶，作為TGF-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)超家族配體的Ⅰ型細(xì)胞表面受體，ALK主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞增生遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但在其它類型的細(xì)胞中也有表達(dá)[14]。TGF-β1與ALK結(jié)合后，活化的ALK與不同類型的Smad蛋白形成復(fù)合體，激活胞內(nèi)Smad蛋白磷酸化，磷酸化的Smad離開原復(fù)合體，在DNA結(jié)合輔助因子的幫助下進(jìn)入胞核內(nèi)，與DNA上的Smad結(jié)合元件結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同下啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，以此來調(diào)節(jié)機(jī)體的生理和病理過程[15]。ALK1和ALK5是研究最多的ALK，ALK1下游Smad信號(hào)分子主要是Smad1/5/8，ALK5下游主要是Smad2/3。在細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，ALK1/ALK5可能發(fā)揮完全不同的作用，比如在腦組織受損時(shí)，ALK1-p-Smad1發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而ALK5-p-Smad2/3則起到促癲癇發(fā)生作用[16]；在培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞中，ALK5促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白、纖維黏連蛋白等)的合成，而ALK1抑制了這一過程，內(nèi)皮糖蛋白可能參與調(diào)控ALK1/ALK5的表達(dá)平衡[17]；在培養(yǎng)的大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，ALK5誘導(dǎo)其成為富含肌動(dòng)蛋白的足體細(xì)胞，以促進(jìn)血管新生，而ALK1抑制這一過程[18]；在硬皮病成纖維細(xì)胞中，已有研究表明，ALK1-p-Smad1途徑促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，但在腎成纖維細(xì)胞中，高表達(dá)Smad2/3反而促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)更多的Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白[19]。

在已有的研究中，并未報(bào)道過TGF-β1受體ALK1和ALK5在翼狀胬肉中的差異表達(dá)。我們通過免疫組織化學(xué)染色和RT-PCR、Western Blot的方法評(píng)估了TGF-β1受體ALK1和ALK5在翼狀胬肉中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常結(jié)膜相比，翼狀胬肉ALK1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而ALK5的表達(dá)減弱。ALK1和ALK5主要表達(dá)于上皮細(xì)胞基底層，這與前述報(bào)道中TGF-β信號(hào)通路通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)胬肉的發(fā)展相一致。一般認(rèn)為，翼狀胬肉來源于結(jié)膜，與正常結(jié)膜的主要區(qū)別在于胬肉處于精確調(diào)控的增殖狀態(tài)，而結(jié)膜的新陳代謝處于動(dòng)態(tài)平衡。由于信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，ALK1在胬肉組織，尤其是胬肉上皮細(xì)胞的表達(dá)增強(qiáng)，或許是胬肉中細(xì)胞增殖活化、細(xì)胞外基質(zhì)合成增加、血管新生的原因，亦或是結(jié)果。ALK1在胬肉組織中的活化抑制了ALK5的表達(dá)，可能是負(fù)反饋調(diào)節(jié)的一種方式，降低了ALK5下游信號(hào)分子的激活，具體的調(diào)控過程有待于進(jìn)一步研究。

本研究的不足之處在于：(1)沒有對(duì)ALK的上下游信號(hào)分子，比如不同類型的Smad在翼狀胬肉與正常結(jié)膜中的表達(dá)差異進(jìn)行闡述；(2)本研究在獲取胬肉標(biāo)本時(shí)并未區(qū)分胬肉的生長(zhǎng)狀態(tài)，ALK的表達(dá)強(qiáng)度在進(jìn)展期的胬肉與靜止期的胬肉中或許會(huì)有所差別，這代表著胬肉不同活動(dòng)期在分子生物學(xué)層面的精確調(diào)控，這或許可以推斷免疫組化結(jié)果中ALK在翼狀胬肉中的染色陽性細(xì)胞比例有較大的差異的原因，該推論需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

細(xì)胞外基質(zhì)的不同組分體現(xiàn)了成纖維細(xì)胞的功能，研究顯示，結(jié)膜和胬肉組織的細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)是有差異的，主要表現(xiàn)為胬肉組織高表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白，而正常結(jié)膜組織高表達(dá)Ⅳ型膠原蛋白，除此之外，胬肉組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表達(dá)比結(jié)膜組織要高得多[20-21]，這種表達(dá)差異或許可以通過TGF-β在結(jié)膜和胬肉中結(jié)合不同的ALK受體，進(jìn)而激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行解釋。有研究表明使用TGF-β受體的抑制劑可以降低翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中MMP-1的表達(dá)，但文中并沒有區(qū)分是哪一種類型的TGF-β受體[22]。進(jìn)一步的研究，比如使用ALK1抑制劑能否抑制胬肉成纖維細(xì)胞的激活，甚至誘導(dǎo)其向結(jié)膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，將會(huì)是一個(gè)有趣的課題。鑒于單純翼狀胬肉切除術(shù)后復(fù)發(fā)率偏高的問題，在翼狀胬肉切除術(shù)后，或許可以局部使用ALK1抑制劑以減少成纖維細(xì)胞的激活，從而降低復(fù)發(fā)率，當(dāng)然由于TGF-β信號(hào)通路的復(fù)雜性和雙向調(diào)節(jié)性，有必要進(jìn)行更深入的分子生物學(xué)研究，以期從根本上揭示翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制，為翼狀胬肉的預(yù)防和治療提供新的思路。