基于氮化碳制備及其生物熒光成像性能研究

陳孟雅，鄭璐璐，楊 翠

（1.上海理工大學(xué) 環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093；2.上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093；3.上海市楊浦區(qū)大橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200090）

引言

近年來，生物成像技術(shù)已在疾病診斷方面，尤其是心血管疾病患者血管成像方面展現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力，成為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中一種有前途的檢測(cè)分析和疾病診斷技術(shù)，熒光成像、磁共振成像（MRI）、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）和多模式成像等多種生物成像技術(shù)也越來越受到關(guān)注[1-3]。生物成像應(yīng)用需求的不斷增長也大大促進(jìn)了各種功能納米材料的合理設(shè)計(jì)和制造，以熒光納米粒子為探針的生物熒光成像技術(shù)，將先進(jìn)的納米材料與生物成像應(yīng)用相結(jié)合，產(chǎn)生了新型生物成像診療平臺(tái)。目前，金屬納米團(tuán)簇[4]、納米尺度金屬?有機(jī)框架[5]、量子點(diǎn)[6]和納米片[7]等多種有機(jī)或無機(jī)熒光材料也被廣泛應(yīng)用于生物血管成像領(lǐng)域。Wang 等[8]以帶正電荷的多肽作為表面配體合成熒光的金納米團(tuán)簇，能夠靶向?qū)?xì)胞核染色。Wang 等[9]以發(fā)光介孔鑭系金屬有機(jī)框架特有的空間結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，水熱法制備雙模發(fā)光多功能納米載體NaLnF4@MOF-Ln 納米復(fù)合材料用于藥物傳遞和細(xì)胞成像。Zheng 等[10]制備釓摻雜碳量子點(diǎn)作為雙模成像探針，用于增強(qiáng)磁共振成像和熒光成像。然而，重金屬材料的毒性限制其在體內(nèi)和體外的應(yīng)用，生物成像越來越希望尋求更安全高效的熒光材料。從2004 年起，Xu 等[11]從碳納米管中提取出了熒光碳納米顆粒，這一發(fā)現(xiàn)使得非金屬熒光材料逐漸被人們所關(guān)注，其中熒光碳基材料具有優(yōu)異的光學(xué)吸收率、化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性和低毒性等優(yōu)點(diǎn)而受到越來越多的關(guān)注[12]。本文對(duì)石墨相氮化碳進(jìn)行剝離以得到石墨相氮化碳納米片，并進(jìn)一步研究了石墨相氮化碳納米片的熒光特性，同時(shí)顯示了其良好的細(xì)胞熒光成像效果，在生物傳感器和成像技術(shù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 石墨相氮化碳的特性

氮化碳（C3N4）是一種低成本且富含碳、氮元素的材料，其中石墨相氮化碳（g-C3N4）是在常溫常壓條件下最穩(wěn)定的存在形式[13]。在石墨相氮化碳中，C、N 原子以sp2形式雜化并連接形成類苯環(huán)的共軛六元環(huán)結(jié)構(gòu)，再相互連接鋪展延伸形成2D 層堆積構(gòu)成類石墨結(jié)構(gòu)，圖1 所示，為三均三嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)單元。2009 年，Wang等[14]發(fā)表了關(guān)于類石墨相C3N4在可見光下分解水制氫的研究工作之后，g-C3N4引起世界范圍內(nèi)研究人員的高度關(guān)注。氮化碳納米材料作為一種新興的材料類別，由于具有獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì)，且不含有毒金屬元素，穩(wěn)定性好，量子產(chǎn)率高以及出色的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，已被作為熒光探針廣泛用于生物傳感領(lǐng)域，如重金屬離子檢測(cè)及生物分子的檢測(cè)[15]。此外，作為一種新型的無金屬聚合半導(dǎo)體，g-C3N4具有可控制的成分、尺寸、厚度、孔結(jié)構(gòu)、尺寸分布和形態(tài)。因此，通過適當(dāng)?shù)母男詠黹_發(fā)g-C3N4材料具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，使其在熒光傳感、生物成像等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[16-18]。

圖1 石墨相氮化碳的晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 Crystal structure of graphitic carbon nitride

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

本文中，若化學(xué)藥品無另外說明均為分析純。三聚氰胺購于國藥控股化學(xué)試劑有限公司，次氯酸鈉購于阿拉丁公司。磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購于賽默飛公司，CCK-8 試劑盒購自碧云天公司。

使用的儀器主要有Bruker D8 Advance X 射線衍射儀（德國），Hitachi-S4800 掃描電子顯微鏡（日本），Hitachi F-4600 熒光分光光度計(jì)（日本），Tecan Spark 多功能酶標(biāo)儀（瑞士），Shimadzu UV-2600 紫外-可見漫反射光譜儀（日本），Carl Zeiss LSM 900 激光共聚焦顯微鏡（德國）。

2.2 石墨相氮化碳的制備

近年來，熱解法[19]是氮化碳制備最常用的方法，是利用含C、N 元素的有機(jī)前驅(qū)體在高溫下發(fā)生縮聚反應(yīng)，其優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)條件簡(jiǎn)單且產(chǎn)率高。由于氮化碳原產(chǎn)物材料分散性較差，不宜應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。為了更好地提高氮化碳的生物利用率，需對(duì)其進(jìn)行改性修飾?；瘜W(xué)剝離法利用氧化還原能力來削弱層間的范德華力，可以得到易分散的納米片，該法耗時(shí)較短且產(chǎn)率較高[20]。制備步驟如下。

1）g-C3N4的制備。以三聚氰胺（12 g）為有機(jī)前驅(qū)體，于馬弗爐程序升溫（5 ℃/min）至550 ℃并保持550 ℃反應(yīng)4 h，得到淡黃色固體g-C3N4。

2）P/g-C3N4的制備。將上述g-C3N4（1 g）在200 mL 的次氯酸鈉溶液（1 mol/L）中進(jìn)行快速磁攪拌5 h。然后，通過離心收集沉淀，用去離子水洗滌3 次，80 ℃真空干燥過夜，得到黃色粉末狀剝離態(tài)g-C3N4（記作P/g-C3N4）。

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

小鼠乳腺癌（4T1）細(xì)胞、人支氣管上皮樣（HBE）細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞恒溫箱培養(yǎng)。將HBE 細(xì)胞接種在96 孔板中培養(yǎng)24 h 后，與由0.22 μm膜過濾的g-C3N4或P/g-C3N4以不同質(zhì)量濃度（0，10，50，100，200，300 μg·mL?1）再孵育24 h，使用CCK-8 法試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率。

為觀察P/g-C3N4的細(xì)胞成像情況，選擇4T1 細(xì)胞鋪于共聚焦培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后，以PBS 沖洗數(shù)次，加入200 μg·mL?1P/g-C3N4，在37 ℃下孵育12 h，用PBS（1 mL）洗滌數(shù)次，然后使用激光共聚焦顯微鏡激發(fā)波長為358 nm通道，獲得4T1 與P/g-C3N4孵育后的共聚焦熒光顯微鏡圖像。

3 結(jié)果與討論

3.1 表征分析

一般來說，由于g-C3N4在水溶液中容易聚集，其分散性較差。因此，制備了g-C3N4分散相，并對(duì)其分散性能進(jìn)行了驗(yàn)證。所制備材料g-C3N4和P/g-C3N4粉末相和分散相中的典型形貌如圖2 所示，g-C3N4和P/g-C3N4粉末都是疏松的黃色粉末。由圖2（b）可以看出，g-C3N4容易沉積而P/g-C3N4在溶液中的分散性能較好。此外，200 mg·L?1樣品分散液的丁達(dá)爾效應(yīng)進(jìn)一步揭示了其分散溶液的穩(wěn)定狀態(tài)（見圖2（c））。這表明P/g-C3N4在水中具有良好的分散性和穩(wěn)定性。

圖2 制備材料在粉末相和分散相中的典型形貌Fig.2 The typical appearances of the as-developed materials in the powder phase and dispersion phase

樣品的X 射線衍射（XRD）能譜如圖3（a）所示，其中g(shù)-C3N4的XRD 能譜圖在2θ=27.4°處出現(xiàn)的最強(qiáng)峰歸屬于芳香族體系的層間堆積特征，（002）面；13.0°處的衍射峰表示平面內(nèi)的結(jié)構(gòu)堆積，（100）面[21]。P/g-C3N4中的這兩個(gè)峰均有明顯減弱，這表明在剝離的過程中，P/g-C3N4的層狀堆積結(jié)構(gòu)與g-C3N4相比減少，形成較薄納米片結(jié)構(gòu)。從圖3（b）紫外?可見漫反射光譜中可以看出，樣品P/g-C3N4相較于g-C3N4在波長大于420 nm 的可見光吸收都有較為明顯的增強(qiáng)，可能是P/g-C3N4層狀剝離不僅提高了其比表面積，增強(qiáng)了光吸收能力，使其具有較高的光催化性能。

圖3 石墨相氮化碳的晶體結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)Fig.3 Crystal structure and optical properties of graphitic carbon nitride

為了進(jìn)一步確認(rèn)P/g-C3N4剝離處理效果，使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察材料表面形貌特征，如圖4 所示。由掃描電子顯微鏡(SEM)圖像觀察到，相比于g-C3N4，P/g-C3N4呈現(xiàn)很多不規(guī)則排列的片狀堆積結(jié)構(gòu)，這與XRD 分析結(jié)果吻合的很好。由此可見，P/g-C3N4材料表面形貌已被剝離成片狀。

圖4 制備材料的SEM 圖Fig.4 The SEM pictures of the as-developed materials

3.2 石墨相氮化碳的熒光特性

石墨相氮化碳相應(yīng)的熒光發(fā)光機(jī)理為：在受到光激發(fā)時(shí)，處于π 軌道基態(tài)的電子會(huì)躍遷至π*軌道激發(fā)態(tài)，并在價(jià)帶留下空穴，之后電子空穴對(duì)復(fù)合時(shí)輻射的熒光可以用于生物成像、熒光傳感等領(lǐng)域。從圖5 熒光光譜圖中可以看出，g-C3N4和P/g-C3N4的熒光發(fā)光的波長范圍是400～560 nm，熒光最強(qiáng)峰位于435 nm 左右。由于對(duì)P/g-C3N4的片層剝離，導(dǎo)致其納米尺寸變小，并且熒光發(fā)射峰發(fā)生些許藍(lán)移。

圖5 石墨相氮化碳熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of graphitic carbon nitride

3.3 細(xì)胞毒性和細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

優(yōu)異的生物安全性是熒光染料應(yīng)用于生物成像必不可少的條件。圖6 是P/g-C3N4作用4T1 細(xì)胞24 h 后的細(xì)胞存活率圖。當(dāng)P/g-C3N4的質(zhì)量濃度達(dá)到300 ug·mL?1時(shí)，細(xì)胞存活率仍在95%以上，表明P/g-C3N4具有較低的生物毒性，因此所制備的P/g-C3N4可成功用于生物領(lǐng)域研究。

圖6 不同質(zhì)量濃度P/g-C3N4對(duì)HBE 細(xì)胞毒性Fig.6 Cytotoxicity of HBE cells co-incubated with different concentrations of P/g-C3N4

由于P/g-C3N4具有優(yōu)異的熒光性能和較低的生物毒性，將P/g-C3N4用于細(xì)胞內(nèi)生物成像，并通過共聚焦顯微鏡觀察其生物成像能力。圖7 為4T1 細(xì)胞和P/g-C3N4培養(yǎng)的熒光共聚焦圖像。從圖中可以看出，4T1 細(xì)胞的形態(tài)在明場(chǎng)圖中清晰可見（見圖7(a)）。當(dāng)用紫外光激發(fā)時(shí)，P/g-C3N4孵育的4T1 細(xì)胞在暗場(chǎng)圖中顯示出較強(qiáng)程度的藍(lán)色熒光（見圖7(b)）。在疊加圖中可以更清楚地看到P/g-C3N4很容易滲透到細(xì)胞中，但沒有穿透細(xì)胞核，細(xì)胞、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間有清晰邊界（見圖7(c)）。這些結(jié)果表明P/g-C3N4 有用于高對(duì)比度生物成像的潛力。

圖7 細(xì)胞共聚焦熒光成像Fig.7 Confocal fluorescence images of cells

4 結(jié)論

簡(jiǎn)單高效地構(gòu)建了具有良好的水溶性、熒光性和良好的生物相容性的材料P/g-C3N4，制備過程簡(jiǎn)單、成本低、穩(wěn)定性高，可用于細(xì)胞的熒光成像。通過材料分散液實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該材料在水中具有良好的分散性和穩(wěn)定性，通過SEM觀察，驗(yàn)證P/g-C3N4材料已被剝離成片狀，同XRD 分析結(jié)果保持一致。紫外–可見漫反射光譜和熒光光譜實(shí)驗(yàn)表明P/g-C3N4材料在藍(lán)綠光發(fā)光波段吸收峰明顯增強(qiáng)，熒光最強(qiáng)峰位于435 nm 左右，增強(qiáng)了材料的光催化性能?；诩す夤簿劢沟募?xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了改性后的納米材料能夠被細(xì)胞吞噬，在紫外光358 nm 激發(fā)下顯示出較強(qiáng)程度的藍(lán)色熒光，其獨(dú)特的熒光和生物特性在生物成像尤其是血管成像等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。高催化性能的材料可以攜帶心血管類治療藥物，通過改性后材料的光催化性能增強(qiáng)藥物的治療效果，在為心血管病人構(gòu)建基于血管成像及治療的診療一體化平臺(tái)上具有良好的潛能。