珍珠龍膽石斑魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定及抑菌試驗(yàn)

于淑池，吳 靜，梁宇晴，李 燁，邢文君，周玲玲

(海南熱帶海洋學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 三亞 572022)

0 引言

茶多酚(Tea polyphenols TP)作為植物源天然抗氧化劑，具有安全性高、抗菌性強(qiáng)、無(wú)毒副作用等特點(diǎn)，在食品保鮮領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[10]，目前茶多酚對(duì)水產(chǎn)品腐敗菌的抑制作用報(bào)道較少[11]9,[12]44,[13]。本研究首先確定4 ℃冷藏珍珠龍膽石斑魚(yú)的貨架期，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)基法結(jié)合16S rDNA技術(shù)分離鑒定貨架期終點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，以茶多酚為抑菌劑，探討其對(duì)冷藏珍珠龍膽石斑魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌作用，以期為珍珠龍膽石斑魚(yú)腐敗菌的靶向抑菌、延長(zhǎng)貨架期提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

珍珠龍膽石斑魚(yú)(體質(zhì)量740±16 g)：采購(gòu)于三亞市荔枝溝路樂(lè)天城農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

培養(yǎng)基及試劑：平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PCA)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母提取物，廣東一品鮮生物有限公司；茶多酚(純度>99%)，食品級(jí)，河南千志商貿(mào)有限公司。

儀器：SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BCD-649WE型冰箱，青島海爾股份有限公司；SQ510C型立式壓力蒸汽滅菌器，重慶雅馬拓科技有限公司；250B數(shù)顯生化培養(yǎng)箱，金壇市盛蘭儀器制造有限公司；Universal Hood II 凝膠成像儀、DYY-10C型電泳儀，BIO-RAD 中國(guó)公司；BSA-2224S型電子天平，斯沃德北京儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.14 ℃冷藏珍珠龍膽石斑魚(yú)貨架期的測(cè)定

購(gòu)買(mǎi)鮮活珍珠龍膽石斑魚(yú)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，致死后放在碎冰上進(jìn)行“三去”(去頭、去鱗、去內(nèi)臟)處理后，用刀沿背脊部剖為兩半后取脊背肉，并切成重量為20 g 左右的魚(yú)片；用自封袋密封后置于4 ℃冰箱貯藏，每隔2 d取樣，對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)片的感官品質(zhì)、總揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N) 、菌落總數(shù)和pH 指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，每種樣品平行處理3次，取均值。

感官評(píng)價(jià)參照于林等[14]對(duì)石斑魚(yú)的感官評(píng)價(jià)方法，10名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的評(píng)定員，每隔2 d對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)片的色澤、氣味、彈性和組織形態(tài)進(jìn)行感官評(píng)分，以4個(gè)項(xiàng)目評(píng)分總和的算術(shù)平均值作為感官評(píng)分結(jié)果，6分以下為感官臨界點(diǎn)；揮發(fā)性鹽基氮指標(biāo)的測(cè)定參照GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的半微量定氮法進(jìn)行；菌落總數(shù)測(cè)定參照國(guó)標(biāo) GB 47892-2016《菌落總數(shù)的測(cè)定》的標(biāo)準(zhǔn)；pH測(cè)定參考藍(lán)蔚青等[15]226的方法進(jìn)行。

1.2.24 ℃冷藏珍珠龍膽石斑魚(yú)腐敗菌的分離純化與鑒定

(1)腐敗菌的分離純化

參照文獻(xiàn)[16-17]方法進(jìn)行腐敗菌的分離純化。根據(jù)貨架期的測(cè)定結(jié)果，無(wú)菌條件下取貨架期終點(diǎn)冷藏的珍珠龍膽石斑魚(yú)肉20 g加入180 mL生理鹽水(無(wú)菌)均質(zhì)，進(jìn)行10倍比稀釋?zhuān)x取10-1～10-6稀釋梯度，每個(gè)稀釋度吸取100 μL涂布于平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基PCA平板上，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；選取菌落數(shù)分散比較均勻的平板，觀察并記錄菌落特征，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶測(cè)試，并計(jì)算同種菌落細(xì)菌占菌落總數(shù)的比例，進(jìn)一步挑取典型的單菌落，重復(fù)平板劃線至少3次以上，得到純化的單菌落。進(jìn)一步進(jìn)行16S rDNA序列分析。

(2)16S rDNA 分析

將貨架期終點(diǎn)純化得到的占比較高的3株腐敗菌進(jìn)行菌落PCR，以檢測(cè)是否為純種；向1.5 mL離心管中加入雙蒸水1 μL，用小移液管的尖頭處蘸取單菌落接進(jìn)雙蒸水中，加入引物27f/1541r模板各2 μL，2×Master Mix 25 μL；PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃、5 min，變性設(shè)1 min，退火55 ℃、1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸5 min，4 ℃冰箱保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，條帶單一后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行16S rDNA 的序列分析。測(cè)序結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源性分析，采用MEGA 7.0.26軟件進(jìn)行序列對(duì)比，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 抑菌試驗(yàn)

(1)茶多酚對(duì)貨架期終點(diǎn)3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌作用測(cè)定

茶多酚的配置：將100 mg 茶多酚溶解于5 mL 0.15 mmol·L-1H3PO4中，配成濃度為20 mg·mL-1的母液，采用濾膜(0.22 μm)過(guò)濾除菌后，保存于為-20 ℃冰箱備用。

抑菌作用測(cè)定參照于淑池等[18]的方法。將冷藏珍珠龍膽石斑魚(yú)貯藏貨架期終點(diǎn)分離鑒定的3株菌，即苺實(shí)假單胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌接種于LB肉湯培養(yǎng)基，搖床振蕩(30 ℃，160 r·min-1)過(guò)夜培養(yǎng)活化后，以2%比例接種于LB液體中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm約為0.5左右，用移液槍吸取菌液100 μL，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，牛津杯打孔，每孔加入不同濃度(0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg·mL-1)茶多酚溶液50 μL，30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，觀察3株菌的生長(zhǎng)抑制情況，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑大小，測(cè)量3次取平均值。

(2)最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

采用平板涂布法[19]測(cè)定MIC，根據(jù)抑菌試驗(yàn)結(jié)果，將茶多酚母液采用二倍比稀釋成6個(gè)濃度，苺實(shí)假單胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌測(cè)定的濃度選擇分別為0.725、1.45、2.9、5.8、11.6 mg·mL-1；0.375、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0 mg·mL-1；0.425、0.85、1.7、3.4、6.8、13.6 mg·mL-1；分別吸取2 mL不同濃度茶多酚溶液于無(wú)菌平皿內(nèi)，再倒入冷卻至45 ℃左右的LB瓊脂培養(yǎng)基18 mL，冷卻凝固后，于平板中均勻涂布100 μL菌液，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度為茶多酚的MIC，每個(gè)濃度重復(fù)操作3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel處理并作圖，利用MEGA 7.0.26軟件對(duì)菌株16SrDNA序列進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.14 ℃貯藏下珍珠龍膽石斑魚(yú)貨架期的確定

2.1.1 貯藏期間感官評(píng)分與TVB-N測(cè)定結(jié)果

由10名訓(xùn)練有素感官評(píng)價(jià)人員組成評(píng)定小組，對(duì)4 ℃貯藏下珍珠龍膽石斑魚(yú)進(jìn)行感官評(píng)分；同時(shí)測(cè)定貯藏期間TVB-N值(用TVB-N表示)的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 4 ℃貯藏條件下珍珠龍膽石斑魚(yú)感官評(píng)價(jià)與揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，珍珠龍膽石斑魚(yú)的感官評(píng)分呈下降趨勢(shì)。貯藏至第6天時(shí)，感官評(píng)分為6分，達(dá)到臨界值，所以選擇6 d為珍珠龍膽石斑魚(yú)4 ℃貯藏下的感官可接受終點(diǎn)。

TVB-N指標(biāo)是指肉類(lèi)及水產(chǎn)品的蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)，在微生物和酶的作用下，分解產(chǎn)生揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)如氨類(lèi)和胺等的數(shù)量[20]，與鮮度有較高的相關(guān)性，是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)，參考鮮海水魚(yú)通則GB/T 18108-2019，TVB-N≤15 mg·100 g-1為一級(jí)鮮度；TVB-N≤30 mg·100 g-1為合格品。從圖1看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N呈不斷上升的趨勢(shì)，第6天為16.8 mg·100 g-1，超過(guò)一級(jí)鮮度的臨界值，第8天為32.2 mg·100 g-1，已超過(guò)臨界值。以TVB-N為指標(biāo)判定的鮮度變化情況稍滯后于以感官品質(zhì)為指標(biāo)判定的結(jié)果。

2.1.2 貯藏期間pH值與菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果

4 ℃貯藏期間石斑魚(yú)魚(yú)肉pH值和菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 4 ℃貯藏條件下珍珠龍膽石斑魚(yú)pH值與菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果

一般水產(chǎn)品一級(jí)鮮度pH值為6.5～6.8，二級(jí)鮮度為6.9～7.0，pH值≥7.1時(shí)魚(yú)肉腐敗[21]。由圖2可知，第0天的pH值為6.6，第4天pH值下降到6.3，第8天pH為7.1，達(dá)到腐敗臨界值。貯藏初期糖原酵解產(chǎn)生乳酸，同時(shí)ATP、磷酸肌酸等物質(zhì)也會(huì)分解產(chǎn)生磷酸等酸性物質(zhì)，使pH值下降；4天以后pH值逐漸上升，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)如揮發(fā)性的氨類(lèi)等引起[15]227,[22]。

Al-Daqal等[23]提出可食用水產(chǎn)品的菌落總數(shù)(TVC)上限是6.0 lg(cfu·g-1)；當(dāng)菌落總數(shù)超過(guò)上限值，表明魚(yú)肉已經(jīng)腐敗。圖2顯示，珍珠龍膽石斑魚(yú)菌落總數(shù)的變化隨貯藏時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸變大，初始值為0.4 lg(cfu·g-1)，第10天達(dá)到6.5 lg(cfu·g-1)，以菌落總數(shù)為依據(jù)判斷珍珠龍膽石斑魚(yú)在第8～10天內(nèi)達(dá)到腐敗。

綜上，感官在第6天達(dá)到腐敗終點(diǎn)，揮發(fā)性鹽基氮和pH值在第8天達(dá)到臨界值，菌落總數(shù)在第10天超出水產(chǎn)品可食用的菌落總數(shù)上限。以感官評(píng)分為確定貨架期的主要指標(biāo)，確定4 ℃貯藏珍珠龍膽石斑魚(yú)的貨架期為6 d。

2.2 4℃貯藏珍珠龍膽石斑魚(yú)腐敗菌的篩選分離

2.2.1腐敗菌的分離純化

采用平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，從4 ℃珍珠龍膽石斑魚(yú)貨架期終點(diǎn)共分離出7株菌，其單菌落特征和革蘭氏染色結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 4 ℃貯藏條件下珍珠龍膽石斑魚(yú)腐敗菌的單菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

圖3的菌落特征顯示，7株菌均已純化為特征一致的單菌落；革蘭氏染色結(jié)果顯示，只有P3為革蘭氏陽(yáng)性菌，其余6株菌均為陰性，陰性菌比例為85.7%，說(shuō)明在貨架期終點(diǎn)，革蘭氏陰性菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，從形態(tài)看，菌株P(guān)3為球形，其余為桿形或短桿形。7株菌的相關(guān)特征描述及比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 貨架期終點(diǎn)(6 d)腐敗菌的主要特征

由表1可知，7菌株菌落顏色為白色、黃色或淡黃色，除P2邊緣不整齊、P3菌落表面干燥、平坦外，其他均為表面光滑，濕潤(rùn)，邊緣整齊，隆起；除P3為革蘭氏陽(yáng)性菌外，其他6菌株均為革蘭氏陰性菌；除P4接觸酶陰性外，其余均為陽(yáng)性；相同菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，P2(21.2%)、P4(28.9%)、P7(35.5%)3菌株占比較高，后續(xù)對(duì)占比高的3株菌(P2、P4、P7)進(jìn)行基因序列分析并鑒定。

2.3 珍珠龍膽石斑魚(yú)腐敗菌的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

2.3.1 3株菌的16S rDNA基因序列分析

對(duì)貨架期終點(diǎn)篩選的比例較高的3株(P2、P4、P7)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行分子鑒定，以優(yōu)勢(shì)腐敗菌的總 DNA 為模板進(jìn)行菌落PCR，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落純度，電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 菌株的 16S rDNA 電泳圖譜

從圖4可見(jiàn)，在 1.5 kb 附近3株菌均出現(xiàn)單一條帶，顯示PCR 擴(kuò)增比較成功，可用于后期測(cè)序。將PCR 產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序，通過(guò) NCBI 軟件將測(cè)序結(jié)果選取同源性最高的菌株序列，采用 MEGA 軟件進(jìn)行多重序列對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。菌株種屬分析結(jié)果見(jiàn)圖5、表2。

圖5 3株腐敗菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

表2 3株腐敗菌的鑒定結(jié)果

從圖5、表2可以看出，液化沙雷氏菌(P2)、哈夫尼希瓦氏菌(P4)、苺實(shí)假單胞菌(P7)與最大相似菌株的相似度均在98%以上，表明鑒定結(jié)果充分可靠。

朱軍莉等[24]研究認(rèn)為，假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、腸桿菌科等腐敗菌均是蛋白分解能力強(qiáng)的嗜冷性革蘭氏陰性菌，是引起有氧冷藏水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要腐敗菌；水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)主要是由水環(huán)境及捕撈后的外源腐敗菌引起，貯藏條件不同，引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的腐敗菌種也有所不同[25],不同水域的魚(yú)、貝類(lèi)等水產(chǎn)品在有氧冷藏條件下[26]或冷鏈流通中[27]的特定腐敗菌多為假單胞菌和(或)希瓦氏菌屬；其中假單胞菌屬會(huì)使水產(chǎn)品產(chǎn)生大量小分子醛、酮、酯及有異味的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物而導(dǎo)致腐敗[28]；海水魚(yú)中廣泛存在的是希瓦氏菌屬[29]，希瓦氏菌產(chǎn)硫能力較強(qiáng)[30]，可以產(chǎn)生大量硫化物，同時(shí)能夠形成黏附能力較強(qiáng)的生物膜[31]，使其黏附在水產(chǎn)品表面，引起腐敗變質(zhì)；沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)是真空包裝和氣調(diào)包裝魚(yú)肉中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[32]，屬于條件致病菌，可以分解肉類(lèi)蛋白質(zhì)，或產(chǎn)紅色色素，引起肉類(lèi)及其制品的腐敗變質(zhì)[33]。

2.4 茶多酚抑菌試驗(yàn)結(jié)果

茶多酚對(duì)液化沙雷氏菌、哈夫尼希瓦氏菌、苺實(shí)假單胞菌3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果見(jiàn)表3。

表3 茶多酚對(duì)3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果

表3顯示，茶多酚對(duì)3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌均具有較好的抑菌作用，隨著茶多酚濃度的增加，抑菌圈直徑逐漸增大，相比而言，對(duì)苺實(shí)假單胞菌的抑制作用最好，液化沙雷氏菌最弱。

根據(jù)抑菌作用結(jié)果，進(jìn)一步測(cè)定得到茶多酚對(duì)苺實(shí)假單胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌的最小抑菌濃度分別為2.9 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、3.4 mg·mL-1。由此可見(jiàn)，茶多酚對(duì)3株菌的抑制作用比較接近，相對(duì)而言對(duì)苺實(shí)假單胞菌的抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌濃度為2.9 mg·mL-1，對(duì)液化沙雷氏菌抑制效果最差，最小抑菌濃度為3.4 mg·mL-1。黃旭鎮(zhèn)[11]25采用菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)大黃魚(yú)源波羅的海希瓦氏菌的MIC為0.75 mg·mL-1，孫京新等[34]采用牛津杯法測(cè)定茶多酚對(duì)假單胞菌的MIC為3.0 mg·mL-1，牛津杯法測(cè)定得最小抑菌濃度要比計(jì)數(shù)法偏高一些[35]，劉五高等[12]46采用平板擴(kuò)散法測(cè)定茶多酚對(duì)肺炎克雷伯菌的MIC為1.024 mg·mL-1，可見(jiàn)不同的細(xì)菌對(duì)茶多酚的敏感性不同，同時(shí)MIC的大小也與測(cè)定方法有一定關(guān)系。

3 結(jié)論

根據(jù)感官評(píng)價(jià)、TVB-N、pH值及菌落總數(shù)等指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，得出4 ℃貯藏下珍珠龍膽石斑魚(yú)貨架期是6 d。采用PCA 平板對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)貨架期終點(diǎn)的腐敗菌進(jìn)行分離純化，共分離篩選出7株菌，革蘭氏陰性菌占比高達(dá)為85.7%；對(duì)貨架期終點(diǎn)占比較高的3株腐敗菌(P2、P4、P7)進(jìn)行鑒定，進(jìn)化樹(shù)分析確定P2為液化沙雷氏菌、P4為哈夫尼希瓦氏菌、P7為苺實(shí)假單胞菌；抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚對(duì)液化沙雷氏菌、哈夫尼希瓦氏菌、苺實(shí)假單胞菌均具有抑制作用，且抑菌效果具有濃度依賴(lài)性，最小抑菌濃度分別為3.4 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、2.9 mg·mL-1。

(責(zé)任編輯：李由明)