內蒙古地區(qū)紋帶棒桿菌臨床分離株的耐藥性及協(xié)同溶血活性

王艷艷張健呂瑩瑩劉柔杉王穎君朝魯門其其格王俊瑞

1內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特010050；2巴彥淖爾市人民醫(yī)院檢驗科，內蒙古巴彥淖爾015000；3內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，呼和浩特010050

紋帶棒桿菌為無芽孢革蘭陽性桿菌，廣泛分布于自然界環(huán)境中，是定植于人體黏膜和皮膚表面的一類正常菌群[1]。近年，隨著抗菌藥物、激素和免疫抑制劑的廣泛使用以及侵入性醫(yī)療操作的增多，紋帶棒桿菌逐漸成為一種重要的條件致病菌[2-4]，可引起肺部、血流和神經(jīng)系統(tǒng)等多部位感染，且多為重癥感染，甚至危及生命[5-6]。目前，針對紋帶棒桿菌的研究主要集中在耐藥性、耐藥機制以及醫(yī)院感染特征等方面[4，7-10]，但關于紋帶棒桿菌協(xié)同溶血作用及其臨床意義的報道少見。本研究對2013—2020年內蒙古地區(qū)500株紋帶棒桿菌臨床分離株的耐藥特征及協(xié)同溶血活性進行初步分析，為進一步了解紋帶棒桿菌的臨床意義及致病性提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、菌株來源

收集2013年11月至2020年5月間內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院和內蒙古巴彥淖爾市人民醫(yī)院住院患者的500株紋帶棒桿菌。樣本來源包括痰液、支氣管肺泡灌洗液、全血、傷口分泌物、尿液、膿液、胸腹水、鼻咽拭子、引流液和導管等。所有患者均對本次研究知情同意。本研究所有菌株均分離自常規(guī)臨床送檢樣本，屬于免倫理審查范圍（免倫理審查批文號：KY2020029）。

二、儀器與試劑

細菌鑒定采用VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）及microTyper MALDI-TOF質譜儀（江蘇天瑞儀器有限公司廈門分公司）進行鑒定和復核。生化鑒定卡為VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)配套的厭氧菌-棒狀桿菌鑒定卡（ANC卡）。血瓊脂平板購自天津金章有限公司。

三、體外藥敏試驗

根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）推薦的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準[11]，采用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗。棒狀桿菌藥敏板由天津金章有限公司定做，肉湯中添加2.5%～5%溶解馬血。依據(jù)文獻[10]選擇實驗用的11種抗菌藥物，濃度設置如下：萬古霉素（0.5~4 μg/mL）、亞胺培南（1~32 μg/mL）、克林霉素（1~16 μg/mL）、利奈唑胺（0.5~4 μg/mL）、頭孢吡肟（1~16 μg/mL）、四環(huán)素（1~16 μg/mL）、復方磺胺甲 唑（0.5/9.5~8/152 μg/mL）、慶大霉素（1~16 μg/mL）、環(huán)丙沙星（1~32 μg/mL）、紅霉素（0.5~8 μg/mL）和青霉素（1~16 μg/mL）。質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC 49619。耐藥譜分型依據(jù)菌株對不同抗菌藥物的敏感性和差異進行統(tǒng)計分析。

四、協(xié)同溶血試驗

參照《臨床微生物檢驗標準化操作》[12]規(guī)范進行協(xié)同溶血試驗操作，標準菌株選用金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）。實驗基本流程如下：先用金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）或銅綠假單胞菌（ATCC 27853）在血瓊脂平板上劃一橫線，再取待檢菌株純培養(yǎng)物與前一劃線做垂直劃線接種，兩者相距0.5~1.0 cm。置35℃孵箱培養(yǎng)24~48 h，觀察結果。

五、統(tǒng)計學分析

采用描述性流行病學方法分析紋帶棒桿菌分布及耐藥情況，計數(shù)資料采用株數(shù)和率表示。

結 果

一、菌株分布

500株紋帶棒桿菌中，451株分離自合格痰液樣本（90.2%），19株分離自傷口分泌物樣本（3.8%），6株分離自支氣管肺泡灌洗液樣本（1.2%），5株分離自尿液樣本（1.0%），4株分離自全血樣本（0.8%），4株分離自鼻咽拭子（0.8%），引流液、胸腹水、膿腫穿刺液樣本各分離3株（0.6%），2株分離自導管樣本（0.4%）。

500株紋帶棒桿菌分離株涉及23個不同科室，其中以重癥監(jiān)護病房檢出率最高（156株，31.2%），其次為神經(jīng)外科（119株，23.8%）和呼吸科（68株，13.6%），其他依次為神經(jīng)內科（28株，5.6%）、骨科（22株，4.4%）、普外科（21株，4.2%）、康復科（19株，3.8%）等。分離出紋帶棒桿菌的患者年齡范圍為5月齡~90歲，以≥60歲者（318例，63.6%）居多，且多數(shù)伴有嚴重的基礎疾病、接受手術治療或有創(chuàng)診療操作。

二、其他病原菌檢出情況

500株紋帶棒桿菌分離株中，216株（43.2%）同時分離出紋帶棒桿菌和其他病原菌，包括鮑曼不動桿菌74株（14.8%）、銅綠假單胞菌42株（8.4%）、金黃色葡萄球菌39株（7.8%）、肺炎克雷伯菌32株（6.4%）、大腸埃希菌20株（4.0%）、嗜麥芽窄食單胞菌20株（4.0%）和陰溝腸桿菌10株（2.0%）；其中7株（1.4%）同時分離出鮑曼不動桿菌和金黃色葡萄球菌，7株（1.4%）同時分離出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

三、體外藥敏試驗結果

500株紋帶棒桿菌分離株對青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、復方磺胺甲 唑、紅霉素、亞胺培南和克林霉素等7種藥物的耐藥率均≥90.0%，且最低抑菌濃度（MIC）也較高（MIC90值為32～≥64 μg/mL），其中環(huán)丙沙星耐藥率最高達到99.2%；亞胺培南耐藥率為90.8%，MIC90值均≥64 μg/mL；對慶大霉素耐藥率為41.8%，中介率高達20.6%，MIC90值≥32μg/mL；對萬古霉素和利奈唑胺耐藥率均為0，MIC90值均為1 μg/mL，暫無耐藥株出現(xiàn)，具體結果見表1。

表1 內蒙古地區(qū)紋帶棒桿菌臨床分離株對抗菌藥物耐藥性分析（n=500）

進一步對500株菌株的耐藥譜分型，500株紋帶棒桿菌劃分為19個耐藥表型，優(yōu)勢耐藥克隆株為R1和R2型，其中R1型占比39.6%，該型菌株對除萬古霉素和利奈唑胺之外其余9種抗菌藥物全部不敏感（大多數(shù)為耐藥，少部分為中介）；R2型占比32.2%，表現(xiàn)為對除萬古霉素、利奈唑胺和慶大霉素之外其余8種抗菌藥物全部不敏感（大多數(shù)為耐藥，少部分為中介），其它17個耐藥型菌株占比僅為28.2%，具體結果見表2。對于優(yōu)勢耐藥克隆株R1和R2型菌株，在2013—2020年間每年都有檢出。

表2 內蒙古地區(qū)紋帶棒桿菌臨床分離株的耐藥表型分析（n=500）

四、菌株耐藥性變化情況

各年份分離的紋帶棒桿菌菌株對四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率變化較大。2013—2019年間慶大霉素的耐藥率呈上升趨勢，2016年增幅最為明顯，2020年耐藥率明顯下降，該年度慶大霉素中介菌株占比11.7%。四環(huán)素耐藥率在2016年和2017年大幅降低，其他年份耐藥率均在70.0%以上。青霉素、頭孢吡肟、復方磺胺甲 唑、紅霉素、克林霉素耐藥率變化不明顯，除2013年之外，其他年份耐藥率均維持在較高水平（≥90.0%）。亞胺培南耐藥率在2014—2020年間維持在高水平上，均在86.0%以上。

五、混合感染菌株耐藥性

對73株混合感染金黃色葡萄球菌和（或）銅綠假單胞菌樣本中的紋帶棒桿菌菌株進行耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、復方磺胺甲唑、紅霉素、亞胺培南和克林霉素等7種藥物的耐藥率均≥90.0%，慶大霉素耐藥率最低為37.0%，但其中介率高達26.0%。具體結果見表3。

表3 混合感染金黃色葡萄球菌和（或）銅綠假單胞菌的紋帶棒狀桿菌耐藥性特征（n=73）

六、協(xié)同溶血試驗結果

500株紋帶棒桿菌中，395株（79.0%）菌株與金黃色葡萄球菌協(xié)同溶血試驗陽性（圖1 A）；393株（78.6%）與銅綠假單胞菌（圖1 B）和金黃色葡萄球菌協(xié)同溶血試驗均為陽性，其主要分布在神經(jīng)外科、ICU和呼吸內科等，這類菌株耐藥表型為R1~R5型，其中99.7%菌株為多重耐藥。有105株紋帶棒桿菌協(xié)同溶血試驗均為陰性，2株菌株僅與金黃色葡萄球菌協(xié)同溶血試驗陽性。在39份同時分離到金黃色葡萄球菌和紋帶棒桿菌的樣本中，有36份（92.3%）樣本菌株協(xié)同溶血試驗陽性；在42份同時分離到銅綠假單胞菌和紋帶棒桿菌的樣本中，有37份（88.1%）陽性。

圖1 紋帶棒桿菌與金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的協(xié)同溶血試驗

討 論

多數(shù)棒狀桿菌為人體黏膜或皮膚表面正常菌群，但近年來研究發(fā)現(xiàn)紋帶棒桿菌檢出率呈明顯上升趨勢[13-15]，有研究報道顯示紋帶棒桿菌具有多重耐藥特征，引起了國內外醫(yī)務工作者的重視[10]。此外，紋帶棒桿菌可在醫(yī)院環(huán)境中長期存在并可引起醫(yī)院內暴發(fā)流行[16]。本研究中檢出的紋帶棒桿菌主要分離自下呼吸道樣本，且這些樣本主要分離自免疫力低下、接受抗菌治療或伴有嚴重基礎疾病的患者，均為紋帶棒桿菌的易感人群[7，10]。

本研究顯示，內蒙古地區(qū)的500株紋帶棒桿菌臨床分離株對11種測試抗菌藥物整體耐藥率較高，與國內其他學者研究結果相近[2，7]；對亞胺培南、紅霉素和慶大霉素耐藥率明顯高于之前其他同類報道[2，7，9，11]。2013—2020年間，紋帶棒桿菌對大部分抗菌藥物耐藥率無明顯變化，但對慶大霉素的耐藥率呈上升趨勢，其耐藥性變遷值得關注。由于菌株收集等原因，2013年和2016年實際測試菌株數(shù)較少，這2個年份所得菌株耐藥率數(shù)據(jù)可能存在較大偏差。耐藥譜分型結果顯示，R1、R2等型別的優(yōu)勢菌株呈多重耐藥特征。在2013—2020年間，優(yōu)勢菌株可在住院患者中持續(xù)檢出，提示其不僅具有多重耐藥特征且具有強大的醫(yī)院內傳播能力[7，10，17]。

溶血素作為金黃色葡萄球菌的一種重要外毒素，是造成金黃色葡萄球菌感染最重要的致病因子之一［18］。此外，研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌溶菌素會協(xié)同破壞類脂和卵磷脂，同時產(chǎn)生細胞毒素增強其宿主侵襲能力[19]。協(xié)同溶血試驗可用于篩查或初步鑒別可促進金黃色葡萄球菌或其他可產(chǎn)生β-溶血素的菌株，同時感染這2種病原菌的患者，金黃色葡萄球菌溶血素的溶血活性將增強，可能會出現(xiàn)更嚴重的溶血，特別是血流感染或重癥感染患者。本研究發(fā)現(xiàn)，分別有79.0%和78.6%的紋帶棒桿菌與金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌具有協(xié)同溶血活性，可能會增強這兩類病原菌的致病性，提示當臨床樣本中同時分離到紋帶棒桿菌和金黃色葡萄球菌和（或）銅綠假單胞菌時，應重新評估紋帶棒桿菌的臨床意義及致病性。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)2株紋帶棒桿菌（C291和C451）對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的協(xié)同溶血活性實驗結果不一致，可能與這2株紋帶棒桿菌菌株所分泌的類協(xié)同溶血因子的結構及活性特征有關，有待進一步探究。

綜上所述，紋帶棒桿菌具有高檢出率和多重耐藥特征，特別是對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌具有協(xié)同溶血活性的分離株，應關注其感染患者可能出現(xiàn)的嚴重溶血反應，及時制定適合的治療方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突