益氣化瘀解毒方對(duì)HBV 相關(guān)性肝癌中乙肝病毒x 蛋白的影響

俞淑嫻，曾普華，郜文輝

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006）

原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，乙型肝炎病毒（ Hepatitis B Virus，HBV）是原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的重要誘因，近70%肝癌患者由HBV 感染導(dǎo)致[1-4]。但HBV 并不能直接誘導(dǎo)肝癌發(fā)生，而乙型肝炎病毒X 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）能通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和多種信號(hào)途徑影響肝癌細(xì)胞增生和凋亡[5]、抑制損傷DNA 的修復(fù)、 影響細(xì)胞周期進(jìn)程并促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)和復(fù)發(fā)，已成為HBV-肝癌發(fā)展的重要生物指標(biāo)[6-8]。因此抑制乙肝病毒的關(guān)鍵致癌基因HBx 的表達(dá)就可以有效阻止肝癌的發(fā)生。

中醫(yī)藥作為惡性腫瘤綜合治療措施中的一個(gè)重要組成部分，在提高機(jī)體免疫力、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間等方面具有優(yōu)勢(shì)，在臨床治療肝癌的過(guò)程中發(fā)揮了積極作用[9-11]。

“益氣化瘀解毒”是湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院應(yīng)用30 余年的臨床效驗(yàn)方。既往臨床研究證實(shí)該方具有穩(wěn)定瘤體、改善生活質(zhì)量、抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而使患者呈現(xiàn)“帶瘤生存”的特點(diǎn)[12]，前期實(shí)驗(yàn)提示該方能抑制人肝癌細(xì)胞和裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[13]，能通過(guò)調(diào)控肝癌PI3K/AKT/mTOR 等信號(hào)通路、細(xì)胞自噬等方式影響細(xì)胞代謝[14-17]。本研究繼以往課題的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察益氣化瘀解毒方對(duì)HBx 的影響，闡明該方對(duì)乙肝病毒誘發(fā)的肝癌防治過(guò)程中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG 2.2.15 細(xì)胞購(gòu)于廣州吉妮歐生物科技有限公司；益氣化瘀解毒方，藥物組成：白參、黃芪、半枝蓮、重樓、醋莪術(shù)、甘草，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房；二甲雙胍、重樓皂苷1（MCE，HY-17471A、HY-N0047）；DMEM- 高 糖、胎牛血清、胰蛋白酶（0.25%）、青霉素-鏈霉素溶液（美國(guó)GIBCO 公司，批號(hào)分別為：11965092、A3160802、25200056、15240062）；二甲基亞砜DMS0（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)）（北京索萊寶公司，批號(hào)：D8371）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：P0013C）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer solution，PBS）、D-Hank's 平衡鹽溶液（D-HBSS）（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)分別為：PB180327、PB180321）；細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8 試劑盒）（美國(guó)APExBIO，批號(hào)： K1018）；MFN1、MFN2、OPA1 抗體（英國(guó) Abcam 公司，批號(hào)分別為：ab104274、ab50838、ab42364）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DEM109-500T）；HIF-1a、FIS1 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：20960-1-AP、10956-1-AP）；QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit 試劑盒（Qiagen，貨號(hào)：204054）。

1.2 方法

1.2.1 HepG 2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2.2.15 細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基（90%DMEM+10%FBS+1%雙抗）中，置于恒溫37 ℃5%CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物制備 益氣化瘀解毒方中藥材，用10 倍純水浸泡30 min，先煎2 h，藥渣再次用8 倍純水煎2 次，3 次煎煮所得藥液5 000 mL，離心去渣（2 500 r/min，5 min），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至每毫克含1 g 藥，共525 mL，凍干粉機(jī)制成凍干粉（1 g/mL），4 ℃冰箱保存，用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋至10 mg/mL。重樓皂苷1：取5 mg 重樓皂苷1 溶于1 mLDMSO 中，待完全溶解加入57 mL 完全培養(yǎng)基得到濃度為100 μmol/L 的母液，用時(shí)將母液稀釋至8 μmol/L；二甲雙胍：將260 mg 二甲雙胍溶于10 mL水，在渦旋混勻儀上充分混勻溶解，加入30 mL 完全培養(yǎng)基配成濃度為100 mmol/L 的母液，用時(shí)將母液配成30 mmol/L。

1.2.3 藥物分組 實(shí)驗(yàn)分為益氣化瘀解毒方組、重樓皂苷1 組、二甲雙胍組、益氣化瘀解毒方加重樓皂苷1 組、益氣化瘀解毒方加二甲雙胍組。

1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)藥物對(duì)HepG 2.2.15 細(xì)胞中HBx 的表達(dá) 不同藥物組分別干預(yù)HepG 2.2.15 細(xì)胞24 h，完全培養(yǎng)基組作為空白對(duì)照組培養(yǎng)24 h，用RIPA 裂解液（加入蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min，離心收集上清，即為總蛋白溶液。BCA 試劑盒檢測(cè)所收集蛋白的濃度。蛋白溶液按4:1 的比例加入5*還原型蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，以每孔50 μg 蛋白上樣，經(jīng)SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h。按抗體說(shuō)明書加入HIF-1α（1:1 000）、MFN1（1:1 000）、MFN2（1:1 000）、FIS1（1:1 000）、OPA1（1:1 000），4 ℃孵育搖床過(guò)夜。加TBST，放在脫色搖床上重復(fù)洗3 次膜，每次用時(shí)5 min，于二抗室溫下培育1 h，再次加TBST 并洗3 次膜，每次5 min。根據(jù)ECL 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行曝光并觀察蛋白的表達(dá)情況，用image J 軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè)HBx基因表達(dá)水平 將HepG 2.2.15細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔8×105個(gè)細(xì)胞。不同藥物組分別進(jìn)行干預(yù)， 完全培養(yǎng)基組作為空白對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS 清洗3 次，用Trizol 試劑盒提取總RNA，各實(shí)驗(yàn)組取2 μg 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用熒光定量 PCR 檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中HBx 基因的表達(dá)水平。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。在 T100TM 型熒光定量PCR 儀 （BIO-RAD） 上用 QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit 試劑盒（Qiagen，Germany）進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

表1 基因引物序列

1.2.6 分子對(duì)接 于PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載HBx（5FCG）共晶體，采用Ledock 軟件對(duì)上述共晶體進(jìn)行刪除多余的水分子、配體、添加氫鍵等蛋白準(zhǔn)備工作；采用ChemDraw.16 軟件構(gòu)建重樓皂苷Ⅰ，并計(jì)算出能量最低狀態(tài)；利用Ledock 軟件進(jìn)行配體處理以及分子對(duì)接程序。最終采用Pymol 軟件展示出重樓皂苷Ⅰ與上述蛋白的分子對(duì)接模擬圖示。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較2 組結(jié)果時(shí)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較多組結(jié)果時(shí)采用ANOVA 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物組對(duì)HepG 2.2.15 細(xì)胞HBx 蛋白的影響 與空白對(duì)照組對(duì)比， 益氣化瘀解毒方組、重樓皂苷I 組、二甲雙胍組、益氣化瘀解毒方加重樓皂苷I組、益氣化瘀解毒方加二甲雙胍組均能不同程度的下調(diào)HBx 蛋白表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見(jiàn)圖1，圖2）

圖1 各組細(xì)胞HBx 蛋白表達(dá)電泳

圖2 各組細(xì)胞HBx 蛋白表達(dá)量比較（± s，n =3）

2.2 益氣化瘀解毒方對(duì)HBx mRNA 的影響 與空白對(duì)照組對(duì)比， 益氣化瘀解毒方組、重樓皂苷I 組、二甲雙胍組、益氣化瘀解毒方加重樓皂苷I 組、益氣化瘀解毒方加二甲雙胍組均能明顯下調(diào)HBx mRNA 表達(dá)水平，差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞 HBx mRNA 的表達(dá)水平（± s，n = 3）

2.3 重樓皂苷I 與HBx 的分子對(duì)接 實(shí)驗(yàn)證明重樓皂苷I 作為單獨(dú)的一組仍然能夠調(diào)控HBx 的表達(dá)，為了進(jìn)一步了解重樓皂苷I 與相關(guān)基因的作用方式，我們利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行可視化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ能夠很好的與HBx蛋白表面的活性空腔進(jìn)行結(jié)合，并且能夠與8 號(hào)組氨酸以及12 號(hào)蘇氨酸形成氫鍵相互作用。見(jiàn)圖4。

圖4 重樓皂苷I 與HBx 分子對(duì)接

3 討論

乙型肝炎病毒x 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）及其編碼蛋白在肝癌轉(zhuǎn)化和惡性轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色[18]。其核心機(jī)制為HBV 感染肝細(xì)胞時(shí)將HBx 整合入宿主細(xì)胞核所導(dǎo)致的肝細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)變異，HBx 基因不與雙鏈DNA 直接作用，而是通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，與蛋白直接作用或誘導(dǎo)蛋白降解，進(jìn)而影響靶蛋白功能[19]，參與癌基因表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)途徑，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管生成、細(xì)胞凋亡、代謝和免疫逃逸等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[20-23]。

益氣化瘀解毒方作為臨床治療肝癌的效驗(yàn)方，全方以“虛”“毒”“瘀”為肝癌的病因病機(jī)，以“癌毒致虛”理論作為指導(dǎo)，以“扶正抗癌”為主要治療理念。中醫(yī)認(rèn)為癌乃“因虛致癌”，先有正氣不足，而后受外來(lái)“邪毒”侵襲，導(dǎo)致毒瘀互結(jié)而成，癌變進(jìn)一步發(fā)展使正氣更虛， 從而又表現(xiàn)出“因癌致虛”的現(xiàn)象，正氣虛、邪毒、血瘀三者始終并存， 互為因果，惡性循環(huán)，貫穿于肝癌整個(gè)病程[24]。在此基礎(chǔ)上確立以“健脾理氣，化瘀軟堅(jiān)，清熱解毒”為基本治法，靈活運(yùn)用白參、黃芪、半枝蓮、重樓、醋莪術(shù)、甘草等將該方擬定為治療肝癌的基礎(chǔ)方。我們前期研究發(fā)現(xiàn)該方具有調(diào)節(jié)免疫、穩(wěn)定瘤體、下調(diào)MVD、VEGF、KDR 表達(dá)、抗血管生成等作用[12-17]。為進(jìn)一步探討益氣化瘀解毒方對(duì)乙肝病毒x 蛋白所誘導(dǎo)的肝癌的作用效果，本實(shí)驗(yàn)擬以益氣化瘀解毒方為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并以重樓皂苷1、二甲雙胍為對(duì)照，觀察各組對(duì)HepG 2.2.15 中HBx 的干預(yù)效果，探討益氣化瘀解毒方對(duì)乙肝病毒中關(guān)鍵治癌因子的影響。

二甲雙胍一直是糖尿病的主要治療藥物，研究表明，二甲雙胍在腫瘤的治療上也有一定作用[25-27]，且治療作用歸因于其調(diào)節(jié)凋亡、自噬、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激、炎癥、代謝穩(wěn)態(tài)和表觀遺傳調(diào)控等上下游分子靶點(diǎn)的能力[28]。二甲雙胍作用機(jī)制的中心是改變細(xì)胞的能量代謝，主要通過(guò)抑制肝臟糖異生和反對(duì)胰高血糖素的作用來(lái)發(fā)揮降糖作用[29]。因此本研究將二甲雙胍作為對(duì)照組。

本研究結(jié)果顯示，益氣化瘀解毒方、重樓皂苷1、二甲雙胍對(duì)HBx 均有不同程度的抑制作用，且益氣化瘀解毒方聯(lián)合重樓皂苷1 抑制效果更佳，說(shuō)明益氣化瘀解毒方中的活性成分可能是重樓皂苷Ⅰ，其機(jī)制可能與抑制乙肝病毒所誘發(fā)的肝癌中關(guān)鍵致癌基因HBx的量，從根源上抑制肝癌的發(fā)生，從而起到治療肝癌的作用有關(guān)。