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    紫鴨跖草CpBURP的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

    2021-11-06 02:58:44彭國穎盧山黃超楊坤萬瑋黃長干
    生物技術(shù)通報(bào) 2021年9期
    關(guān)鍵詞:信號(hào)肽甘藍(lán)型結(jié)構(gòu)域

    彭國穎 盧山 黃超 楊坤 萬瑋 黃長干

    (1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)/南昌市植物資源化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330045;2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校友辦,南昌 330045)

    重金屬污染日益成為影響農(nóng)作物產(chǎn)量的重要因素,銅作為重金屬污染物之一,在污染土壤時(shí)具有毒性和高持久性,而植物修復(fù)技術(shù)[1]是一種很有潛力、且環(huán)保的清除環(huán)境污染的綠色技術(shù),通過超積累植物吸收污染物來達(dá)到修復(fù)土壤、水及空氣的目的。目前,國內(nèi)外研究較多的超積累植物有東南景天(Sedum alfredii)[2]、蜈 蚣 草(Pteris vittata)[3]、藍(lán) 遏 菜(Thlaspi arvens)[4]、印 度 芥 菜(Brassica juncea)[5]、車前草(Herba plantaginis)[6]等植物。紫鴨跖草(Commelina purpurea)是一種超積累銅植物[7],其耐受銅離子的能力強(qiáng)于其他普通植物,在修復(fù)銅污染的土地具有一定的潛力。因此,從分子水平上研究紫鴨跖草的耐銅機(jī)制具有重要的意義。

    BURP蛋白為植物特有蛋白,由一類具有相似的初級(jí)結(jié)構(gòu)且含有BURP保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[8],在植物生長過程中,BURP蛋白不僅參與植物種子的生長發(fā)育,而且在植物抵抗非生物脅迫時(shí)也具有重要的作用[9]。BURP蛋白是由BNM2(小孢子蛋白)、USP(種子非儲(chǔ)存蛋白)、RD22(脫水反應(yīng)蛋白)和PG1β(多聚半乳糖醛酸酶同工酶)4種蛋白質(zhì)共同組成[10],甘藍(lán)型油菜中的BNM2會(huì)參與甘藍(lán)型油菜的小孢子的產(chǎn)生及發(fā)育[11];蠶豆種子中的USP參與種子的發(fā)育,Vokkaliga等[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥USP基因的異位表達(dá)會(huì)影響種子的生長發(fā)育;RD22的發(fā)現(xiàn)源于擬南芥的脫水反應(yīng)蛋白,其是植物應(yīng)在非生物脅迫中的重要蛋白。José等[13]發(fā)現(xiàn)大豆GmRD22蛋白的異源表達(dá)會(huì)提高水稻對(duì)鹽脅迫的抗逆性,鐘活權(quán)[14]研究表明擬南芥受銅脅迫后,通過上調(diào)AtRD22的表達(dá)而提高自身的抗脅迫能力;番茄PG1β通過調(diào)節(jié)果實(shí)成熟過程中果膠的溶解的程度參與到果膠代謝中[15]。

    目前,還未有關(guān)于紫鴨跖草BURP基因的報(bào)道。本研究依據(jù)紫鴨跖草的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,應(yīng)用HMMER 3.0程序篩選出CpBURP,并克隆出CpBURP,通過運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)CpBURP蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、二/三級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及對(duì)同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹等方面進(jìn)行探究分析,并利用qRT-PCR分析在Cu2+脅迫下紫鴨跖草根、莖、葉中的CpBURP表達(dá)量,為后期紫鴨跖草的BURP基因的深入研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    剪取紫鴨跖草的嫩莖,用5 g/L高錳酸鉀溶液消毒后放進(jìn)霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng),待培養(yǎng)30 d后,嫩根長成,分別在0、50、100和300 μmol/L Cu2+的霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d,以各Cu2+營養(yǎng)液培養(yǎng)的紫鴨跖草根、莖、葉為試驗(yàn)材料,取樣后迅速用液氮冷凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    以紫鴨跖草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為篩選BURP基因的數(shù)據(jù)庫。

    1.2 方法

    1.2.1 基因的篩選與克隆 從Pfma數(shù)據(jù)庫中下載BURP基因家族保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(Pfam:PF03181),運(yùn)用HMMER 3.0程序在紫鴨跖草的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索篩選出一個(gè)基因,再利用SMART確定其編碼的蛋白具有BURP結(jié)構(gòu)域,利用NCBI確定其具有完整的開放閱讀框,將該基因命名為CpBURP。

    采取Trizol法提取紫鴨跖草的總RNA,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)CpBURP引物(CpBURP-F:5'-AACCCCTTCACTGCAAAGGC-3',CpBURP-R:5'-ATCCGCGACGGTCCATGT-3'),進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增。用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)、回收,將目的基因與載體pMDTM19-T連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,篩選陽性克隆進(jìn)行菌液擴(kuò)增并測(cè)序(普洛麥格克公司)。

    1.2.2 CpBURP的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用Expasy在線軟件分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì);運(yùn)用MotifSearch在線軟件分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域;運(yùn)用NetPhos 3.1 Server在線軟件分析蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn);運(yùn)用Prabi在線軟分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu);運(yùn)用SWISSMODEL在線軟件分析蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu);運(yùn)用TMHMM在線軟件分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽;運(yùn)用SignalP 4.1 Server在線軟件分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域;運(yùn)用PSOR在線軟件分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位;在NCBI中檢索擬南芥、蘋果(Malus domestica)、黃瓜(Cucumis sativus)、香瓜(Cucumis melo)、野大豆(Glycine soja Sieb)、花生(Arachis hypogaea)、木豆(Cajanus cajan)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、刺毛黧豆(Mucunapruriens)、辣椒(Capsicum annuum)、甘藍(lán)型油菜、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)等13個(gè)物種的BURP蛋白,運(yùn)用MEGA7軟件(neighbour joining tree法)將13個(gè)物種BURP蛋白與CpBURP蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、并運(yùn)用EVOLVIEW在線軟件美化。

    1.2.3 CpBURP的qRT-PCR分析 選取泛素連接酶(Ubiquitin,UBI)基因(UBI-F:5'-AGCACTCTTCACCTCGTCC-3';UBI-R:5'-CTTCGCCTTCACATTCTC-3')作為內(nèi)參基因,分析CpBURP(F:5'-TTTGAAGTTTAGTAACTATGATGCG-3';R:5'-CATTCCCATCTTGCGCATAGTTCAT-3')的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)熒光定量儀LightCycler 480 System進(jìn)行反應(yīng),每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)程序如圖1,運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

    圖1 qRT-PCR擴(kuò)增程序Fig.1 Amplification procedure of qRT-PCR

    2 結(jié)果

    2.1 CpBURP的克隆

    以紫鴨跖草的cDNA為模板,以CpBURP-F和CpBURP-R為引物擴(kuò)增出一條1 383 bp的特異性條帶(圖2-A),經(jīng)菌液PCR檢測(cè)(圖2-B)和測(cè)序,結(jié)果表明,該條帶為目的基因。

    圖2 CpBURP的擴(kuò)增和PCR檢測(cè)Fig.2 Amplification and PCR detection of CpBURP

    2.2 CpBURP蛋白理化性質(zhì)分析

    CpBURP可編碼含460個(gè)氨基酸的蛋白(圖3),分子量為49.3 kD,分子式為C2153H3260N594O710S15,脂肪系數(shù)為56.37。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為51,帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為42,等電點(diǎn)(pI)為5.46。CpBURP的不穩(wěn)定系數(shù)為26.91,為穩(wěn)定蛋白;CpBURP蛋白的總平均親水系數(shù)為-0.448,為親水蛋白(圖4)。

    圖3 CpBURP核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 3 CpBURP nucleotide sequence and its encoded amino acid sequence

    圖4 CpBURP蛋白的親疏水性分析Fig.4 Hydrophilic and hydrophobic analysis of CpBURP protein

    2.3 CpBURP蛋白保守結(jié)構(gòu)域

    通過分析CpBURP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(圖5),發(fā)現(xiàn)CpBURP蛋白的氨基酸序列具有一個(gè)BURP保守結(jié)構(gòu)域,說明CpBURP屬于BURP基因家族。

    圖5 CpBURP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 Conserved domain of CpBURP protein

    2.4 CpBURP蛋白的磷酸化位點(diǎn)

    CpBURP蛋白共含有50個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖6),分別是31個(gè)絲氨酸(serine)位點(diǎn)、14個(gè)蘇氨酸(threonine)位點(diǎn)和5個(gè)酪氨酸(tyrosine)位點(diǎn)。

    圖6 CpBURP蛋白的磷酸化位點(diǎn)Fig. 6 Phosphorylation sites of CpBURP protein

    2.5 CpBURP蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

    CpBURP蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7所示,CpBURP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由21.09%的α螺旋、27.39%的延伸鏈、6.74%的β轉(zhuǎn)角和44.78%無規(guī)卷曲組成。

    圖7 CpBURP蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Analysis of the secondary and tertiary structure of CpBURP protein

    2.6 CpBURP蛋白的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

    跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖(圖8-A)顯示CpBURP蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu),表明CpBURP蛋白不是跨膜蛋白;信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖(圖8-B)顯示CpBURP蛋白不含信號(hào)肽,表明CpBURP蛋白不是分泌蛋白。

    圖8 CpBURP的跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析Fig.8 Transmembrane structure and signal peptide prediction of CpBURP

    2.7 CpBURP蛋白亞細(xì)胞定位

    CpBURP蛋白的亞細(xì)胞定位分析表明:CpBURP蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性最高,概率為0.450;其次是過氧化物酶體,概率為0.449;定位在線粒體基質(zhì)和溶酶體可能性較低,概率均為0.100。因此,推斷CpBURP蛋白作用于細(xì)胞質(zhì)和過氧化酶體中的可能性較大。

    2.8 構(gòu)建BURP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

    為了探究紫鴨跖草CpBURP蛋白與其他植物BURP蛋白之間的親緣關(guān)系,將CpBURP蛋白與13種植物的BURP蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖9)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,14個(gè)物種的53個(gè)BURP蛋白分為6個(gè)亞類,其中CpBURP蛋白與甘藍(lán)型油菜的BURP蛋白親緣性最高,其次是擬南芥的BURP蛋白。

    圖9 不同物種BURP蛋白與CpBURP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.9 Phylogenetic tree analysis of BURP proteins and CpBURP protein of different species

    2.9 Cu2+脅迫下CpBURP的表達(dá)差異分析

    qRT-PCR分析結(jié)果如圖10所示,CpBURP在根中表達(dá)量最高,其次是葉和莖。隨著Cu2+濃度的增加,根、莖、葉中的CpBURP表達(dá)量均是先升高再降低,其中,根中CpBURP在100 μmol/L Cu2+脅迫后表達(dá)量最高,較對(duì)照組(0 μmol/L Cu2+)的表達(dá)量增加了約1倍,說明CpBURP在紫鴨跖草抵抗Cu2+脅迫中具有一定的調(diào)控作用。

    圖10 CpBURP在Cu2+脅迫下的表達(dá)變化Fig.10 Expression changes of CpBURP under Cu2+ stress

    3 討論

    BURP蛋白在許多植物中已被鑒定出,這類蛋白質(zhì)在植物無融合生殖、種子的生長發(fā)育、果膠代謝以及在重金屬離子、鹽、外源脫落酸、干旱等脅迫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要的功能[16]。目前對(duì)BURP基因的研究大多集中于模式植物(擬南芥)[17]、糧食作物(水稻、玉米等作物)[18]和經(jīng)濟(jì)作物(甘藍(lán)型油菜、蠶豆和番茄等作物)[19],隨著越來越多植物成為基因材料研究的對(duì)象及新植物的基因組測(cè)序完成,更多物種的BURP基因?qū)?huì)被發(fā)掘并報(bào)道出,BURP基因的功能及作用機(jī)制也將進(jìn)一步被擴(kuò)展。紫鴨跖草作為一種超積累銅植物,且BURP蛋白具有抗銅脅迫的功能,因此研究CpBURP對(duì)深入了解紫鴨跖草的耐銅機(jī)制具有一定的推動(dòng)作用。

    因紫鴨跖草暫無基因組數(shù)據(jù)庫,本研究采用紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,利用BURP蛋白的Pfam模型在HMMER 3.0程序搜索并篩選出CpBURP。本研究從紫鴨跖草中克隆出CpBURP,再利用生物信息學(xué)分析了CpBURP蛋白結(jié)構(gòu)特征、功能,運(yùn)用qRTPCR分析CpBURP的表達(dá)模式。CpBURP蛋白是穩(wěn)定蛋白和親水蛋白;含磷酸化位點(diǎn)和BURP保守結(jié)構(gòu)域,不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)CpBURP蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和過氧化酶體中的概率較大。CpBURP蛋白與擬南芥和甘藍(lán)型油菜的BURP蛋白親緣性較高,進(jìn)一步確定CpBURP是BURP基因。CpBURP在紫鴨跖草各組織中均有表達(dá),在Cu2+脅迫時(shí),根的CpBURP表達(dá)量明顯增加,說明根中CpBURP表達(dá)有利于紫鴨跖草抵抗Cu2+脅迫。

    與動(dòng)物相比,植物不能進(jìn)行遷移,因此在應(yīng)對(duì)生長發(fā)育過程中的各種外界環(huán)境因素的脅迫時(shí),植物都會(huì)具有自己獨(dú)特的防御系統(tǒng)及應(yīng)對(duì)機(jī)制,例如馬鈴薯(Solanum tuberosum)調(diào)節(jié)WRKY應(yīng)對(duì)干旱脅迫[20]、葡萄(Vitis vinifera)調(diào)節(jié)MATE應(yīng)對(duì)鹽脅迫[21]、馬藺(Iris lactea)調(diào)節(jié)HMA3應(yīng)對(duì)重金屬鎘脅迫[22]、小黑楊(Opulus simonii×Populus nigra)調(diào)節(jié)CCH10應(yīng)對(duì)重金屬銅的脅迫[23]等。BURP基因作為一種植物特有基因,不僅參與應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫,還在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用。到目前為止,還沒有關(guān)于對(duì)紫鴨跖草BURP基因/蛋白的研究分析,本研究首次從紫鴨跖草中分離出CpBURP,并運(yùn)用生物學(xué)工具及qRT-PCR對(duì)其進(jìn)行全面分析,為后續(xù)深入解析超積累銅植物紫鴨跖草的BURP基因功能及作用機(jī)制上提供參考依據(jù)。

    4 結(jié)論

    克隆了全長為1 383 bp的CpBURP,其編碼的CpBURP蛋白含有BURP保守結(jié)構(gòu)域,為親水蛋白,與甘藍(lán)型油菜的BURP蛋白具有較高同源性。CpBURP在根中的表達(dá)量最高,且Cu2+脅迫明顯能提高紫鴨跖草根的CpBURP表達(dá)量。CpBURP極有可能參與紫鴨跖草的耐銅應(yīng)答。

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