青貯飼料的優(yōu)良乳酸菌及其應用

徐進益 那彬彬 劉順 陳超 孫紅 鄭玉龍

（貴州大學動物科學學院，貴陽 550025）

青貯能有效地保存飼草青鮮狀態(tài)，同時提高飼料營養(yǎng)價值［1］、改善風味、增強適口性，是一種非常重要的飼草貯存方式。青貯發(fā)酵是一個極其復雜的微生物活動體系，原料附著的微生物種屬、數(shù)量、活性、生長繁殖能力、產(chǎn)酸、耐脅迫能力以及環(huán)境溫度等因素都能直接影響青貯效果［2］。一般來說，當乳酸菌成為優(yōu)勢菌群，青貯則容易成功，反之，好氧菌或霉菌成為優(yōu)勢菌群則會導致青貯失?。?］。因此，合理調(diào)節(jié)青貯內(nèi)微生物群落是青貯成功有效措施之一［4］。所以，可以通過添加各式各樣的青貯微生物添加劑提高青貯成功率，但由于大部分菌劑存在適用范圍小、功能單一化等缺點，并不能滿足不同原料、不同地區(qū)、不同氣候環(huán)境下的實際生產(chǎn)。因此根據(jù)實際情況，從不同地方和來源篩選、分離、培育出更多優(yōu)良青貯菌種用于生產(chǎn)，對改善各地區(qū)的青貯品質(zhì)具有重要意義。本文基于國內(nèi)外篩選的優(yōu)良青貯乳酸菌及利用的相關研究，圍繞青貯飼料優(yōu)良乳酸菌種的類型、功能、作用機制、不同類型菌種的分離篩選以及應用等方面現(xiàn)狀進行綜述，并對其未來發(fā)展方向提出建議和展望，以期為后續(xù)的科研工作和實際生產(chǎn)提供參考。

1 青貯乳酸菌的類型及作用機制

隨著現(xiàn)代分子生物技術與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術相結(jié)合，青貯飼料內(nèi)越來越多微生物被發(fā)掘，已檢測到的有乳酸菌、巴氏梭菌、厭氧芽胞梭菌屬、芽胞桿菌屬、腸桿菌屬、乙酸菌、酵母菌等［5］，而對發(fā)酵起主要作用的是乳酸菌。

青貯中常見乳酸菌屬主要有乳桿菌屬（Enterococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、腸球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）等［6］，根據(jù)代謝類型可分為同型乳酸菌（腸球菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、部分乳桿菌屬）和異型乳酸菌（明串珠菌屬、部分乳桿菌屬），同型乳酸菌的代謝產(chǎn)物只有乳酸，而異型發(fā)酵乳酸菌除了乳酸，還有乙酸、乙醇和 CO2等。一般來說與同型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵相比，異型發(fā)酵乳酸菌青貯時的能量損失更高、干物質(zhì)回收率更低，但它產(chǎn)生的乙酸具有較好的抑菌性，能有效提高飼料有氧穩(wěn)定性［7］，逐漸受到人們的重視。相對來說，其中乳桿菌屬的菌種類型最多，明串珠菌屬和腸球菌屬具有較高發(fā)酵潛力，而片球菌屬屬于產(chǎn)酸特性較好的兼性異型厭氧菌［8］，鏈球菌屬和乳球菌屬較少檢測到。

乳酸菌的作用機制是在密閉環(huán)境快速生長繁殖，產(chǎn)生大量乳酸，形成酸性無氧環(huán)境后，有氧菌逐漸死亡，其進一步形成優(yōu)勢菌群，將更多碳水化合物轉(zhuǎn)化成乳酸和其他有機酸（乙酸、丙酸等），將青貯飼料pH降得更低，達到抑制更多厭氧腐敗微生物的生長繁殖和最大限度地減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失目的，使飼料得以長期保存［9］。因此，青貯時應用優(yōu)良乳酸菌添加劑，能有效提高青貯成功率，加強青貯乳酸菌篩選以及菌劑開發(fā)研究很有必要。

2 傳統(tǒng)常見乳酸菌的篩選及應用

隨著青貯發(fā)展需要，人們不斷探尋著能改善青貯質(zhì)量的優(yōu)良乳酸菌。目前學者們多以乳酸菌的產(chǎn)酸能力、活性高低、耐脅迫和抑菌能力以及對飼料有氧穩(wěn)定性影響等傳統(tǒng)篩選標準，篩選出了許多生理性能較好的菌種，且多數(shù)菌株在青貯實驗中都有不錯的應用效果。

2.1 產(chǎn)酸能力和活性強的乳酸菌

快速降低飼料pH是乳酸菌的主要目標，也是成功青貯的關鍵。較強的產(chǎn)酸能力能使pH快速下降，而活性越高越容易成為優(yōu)勢菌種，因此這兩點常被學者作為篩選的首要標準。

首先，同型發(fā)酵植物乳桿菌是在青貯中應用最廣泛的乳酸菌，多數(shù)地區(qū)均以其為主［10］，目前已有許多優(yōu)良植物乳桿菌被篩選出來，如學者從泡菜中篩選的植物乳桿菌SD2［11］，從香蕉殘次果和香蕉花上篩選的植物乳桿菌CG1、CG5、CG7和CH2［12］，還有從發(fā)酵柑橘皮渣［13］、天然發(fā)酵傳統(tǒng)食品［14］分別篩選得到的植物乳桿菌Q5、A5，這些乳酸菌不僅活性高，而且產(chǎn)酸能力強，其中Q5發(fā)酵2 h即可進入對數(shù)生長期，而在香蕉殘次果和果柄青貯中添加CG1后，處理組的pH、有機酸、常規(guī)營養(yǎng)成分等指標都表現(xiàn)更好。其次，還有學者從玉米中篩選得到的異型發(fā)酵短小乳桿菌SDMCC05029［15］，從葡萄藤、苜蓿、甘蔗尾等青貯飼料中篩選得到糞腸球菌P-2.1［16］、戊糖片球菌a144［17］、屎腸球菌（GN3、GN11、GN12）［18］、干酪乳桿菌Y42和副干酪乳桿菌Y32［19］等，均是產(chǎn)酸能力強、活性高的優(yōu)良乳酸菌種，其中TSy1-3能快速將MRS液體培養(yǎng)基600 nm的光密度值升高到3.015，a144能夠適應苜蓿低糖條件，將SDMCC05029添加到玉米秸稈青貯后能使pH值降低更迅速，而屎腸球菌GN3、GN11、GN12也能使三江源試驗區(qū)燕麥青貯品質(zhì)得到顯著改善。

上述篩選得到的產(chǎn)酸能力強、活性高的優(yōu)良乳酸菌多為同型乳酸菌，也有部分異型發(fā)酵乳酸菌，比如短小乳桿菌SDMCC05029［15］既能改善青貯品質(zhì)，又對提高飼料有氧穩(wěn)定性有非常重要的作用。而且，多數(shù)菌種均可作為制備青貯飼料發(fā)酵劑的優(yōu)良菌種資源，但由于與生產(chǎn)實踐結(jié)合不緊密，導致許多優(yōu)良菌株無法得到實際應用，若能將其發(fā)展為商業(yè)菌株，則能更好服務于青貯飼料生產(chǎn)。

2.2 提升飼料有氧穩(wěn)定性的乳酸菌

對于一些緩沖能值低的植物則易成功青貯，如全株玉米，但使用過程中容易發(fā)生有氧變質(zhì)，一旦變質(zhì)，則將前功盡棄，因此提升飼料的有氧穩(wěn)定性也是重中之重。研究發(fā)現(xiàn)，接種某些異型發(fā)酵乳酸菌能有效提升飼料有氧穩(wěn)定性，如萬學瑞等［20］將從玉米青貯飼料篩選得到的5株乳酸菌（2株同型乳酸菌和3株異型乳酸菌），用作復合菌劑添加到全株玉米青貯中，有效提升了飼料的有氧穩(wěn)定性，還提高了青貯品質(zhì)。同樣，Huang等［21］也將自篩菌株布氏乳桿菌9-2、10-1接種青貯玉米后，對照組相比，青貯料中乙酸濃度得到了提高，這兩株菌在提高飼料有氧穩(wěn)定性方面的表現(xiàn)更好。而琚澤亮等［22］將篩選得到的鼠李糖乳桿菌HT1添加于燕麥不同溫度青貯后發(fā)現(xiàn)，45℃下HT1處理的乙酸含量更高，酵母菌和好氣性細菌數(shù)量都較低，HT1處理有效提高了燕麥青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。異型發(fā)酵乳酸菌可能對發(fā)酵過程改善影響不大，但對防止飼料發(fā)生有氧腐敗有重要意義。

青貯飼料有氧暴露變質(zhì)是實際生產(chǎn)中無法避免的問題，有效增強飼料有氧穩(wěn)定性有助于延長青貯飼料有氧暴露時間，為飼喂階段爭取時間，對飼料后期的利用有重要意義，因此該類菌株的篩選應作為常規(guī)持續(xù)關注的問題。

2.3 耐脅迫能力強的乳酸菌

乳酸菌除了需有較強的產(chǎn)酸能力和活性外，耐脅迫能力也很重要，其一定程度代表了菌株競爭力和適應力的強弱，而研究較多的主要是菌株對酸、低溫和高溫的脅迫能力。

乳酸菌的耐酸能力越好表明其能在更低的pH環(huán)境下正常生長，促進更好地發(fā)酵，如學者們從苜蓿制備菌粉中、蔬菜尾菜中分別篩選出來植物乳桿菌R1、R5［23］和植物乳桿菌C20［24］，還有從不同青貯中篩選得到乳桿菌SBR64.7［25］、植物乳桿菌SBR64.7［14］、干酪乳桿菌1-10［26］、戊糖片球菌F04［27］，其中多能耐pH為4的酸，F(xiàn)04在pH 3.5左右也能正常生長，能在12 h內(nèi)迅速繁殖和產(chǎn)酸，而SBR64.7還表現(xiàn)出了對pH2.0耐受性，可以看出上述菌株的耐酸脅迫能力都很好，合理利用能使青貯pH降得更低。

青貯一般在秋天進行，對于一些常年溫度較低的地區(qū)（如我國北方和西藏等地區(qū)）來說，秋冬季節(jié)溫度更低，菌的活性會受到抑制，普通菌株往往改善效果不好。為了找到適宜西藏地區(qū)低溫環(huán)境的發(fā)酵優(yōu)良菌株，許冬梅等［28］從青藏高原牧草附著菌中篩選得到了4株優(yōu)質(zhì)乳酸菌（植物乳桿菌31、干酪乳桿菌Q5、戊糖片球菌Q6和棒狀乳桿菌Q7），都在低溫環(huán)境下表現(xiàn)出較高的活性和產(chǎn)酸能力。而荊佩欣等［29］將篩選的耐低溫戊糖片球菌添加至垂穗披堿草青貯后發(fā)現(xiàn)，該組pH更低，乳酸含量更高，改善效果強于普通商業(yè)菌株。東北地區(qū)的高寒環(huán)境下對青貯發(fā)酵更不利，陳龍等［30］為了篩選適合高寒環(huán)境下低溫青貯的菌株資源，從長白山原始森林土壤中分離到了3株植物乳桿菌C34、C37和C421，在低溫條件下也有較好的產(chǎn)酸能力和活性。而在我國某些南方地區(qū)的高溫高濕氣候，往往會導致發(fā)酵溫度更高，青貯成功率降低，因此耐高溫菌種的篩選也很有必要。學者從西南高溫高濕地區(qū)青貯飼料中篩選出的植物乳桿菌LP14937［31］和從玉米原料中篩選的鼠李糖乳桿菌753［32］，均能在45℃高溫條件下較快生長且產(chǎn)酸能力強，而且LP14937還有較好的耐鹽和酸堿脅迫能力、糖源利用能力，這類乳酸菌的應用有望提高熱帶和亞熱帶地區(qū)青貯飼料品質(zhì)，應用到青貯實驗中能為實際生產(chǎn)提供一定參考。

常年生活在這些極端環(huán)境中的菌株，對環(huán)境已有了較好的適應力。特殊環(huán)境下往往存在許多具有適應該地區(qū)的特殊生理能力的天然優(yōu)良乳酸菌菌群，這些菌種有作為該環(huán)境下青貯優(yōu)良后備菌種的潛力，將這些優(yōu)良鄉(xiāng)土菌種資源加以正確發(fā)掘和利用，有利于建立適用于這些地區(qū)青貯飼料的技術體系。

2.4 抑菌能力較好的乳酸菌

青貯發(fā)酵時有害菌（霉菌、大腸桿菌和酵母菌等）的繁殖生長，會大量消耗飼料營養(yǎng)物質(zhì)，嚴重則會青貯失敗，特別是對于緩沖能值較高的植物，自然青貯更易腐敗霉變。因此篩選抑菌能力好的乳酸菌有助于改善發(fā)酵過程，提高青貯品質(zhì)，郝湘妹等［33］從實驗室保存乳酸菌中篩選到能抑制黑曲霉、米曲霉及其它曲霉菌活性的植物乳桿菌ZZUA493，且將其添加到苜蓿青貯后能顯著降低青貯料的pH，增加乳酸和乙酸的含量，提升青了貯品質(zhì)；還有學者從青貯料中篩選出有防霉效果好的魏斯氏球菌DHL-9［34］和能明顯抑制黃曲霉菌的植物乳桿菌［35］，抑菌效果均不錯。而酵母與大腸桿菌的繁殖會導致飼料營養(yǎng)物質(zhì)快速流失，抑制其生長有助于保證發(fā)酵的正常進行，因此有學者嘗試從青貯料中篩選能抑制大腸桿菌的乳酸菌，最終分離得到了一株植物乳桿菌YM1.1［36］，抑菌直徑能達到（11.5±0.17）mm；還有學者從不同植物表面和青貯中分離得到植物乳桿菌ZZUA341［37］、植物乳桿菌ZZU203［38］、植物乳桿菌R4-26［39］和戊糖片球菌P16和希氏腸球菌C20［40］均具有較好的抑菌性能，其中P16不僅對大腸桿菌的抑制能力強還具有很好的耐酸鹽脅迫能力，而植物乳桿菌R4-26對真菌毒素有很強的抑制作用，用其作添加劑處理青貯后，有效地抑制霉菌的生長，改善了青貯質(zhì)量。

由此可見，篩選出抑菌能力較好的乳酸菌并加以實際利用，不僅能改善青貯發(fā)酵過程提升青貯品質(zhì)，還能一定程度上減輕由霉菌造成的污染，提高飼料的安全性和飼喂價值，為尋找生產(chǎn)安全、無毒青貯飼料的生物方法奠定一定的基礎。

3 特殊功能乳酸菌的分離篩選及應用

人們已根據(jù)傳統(tǒng)的篩選標準篩選分離了許多優(yōu)良菌珠，并取得了不錯的應用效果，但隨著青貯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與進步，部分根據(jù)傳統(tǒng)標準篩選的菌種在實際生產(chǎn)中已經(jīng)滿足不了青貯需求，因此根據(jù)一些新標準篩選特殊功能優(yōu)良菌種是發(fā)展所趨。

3.1 木質(zhì)纖維素降解乳酸菌

植物細胞壁主要有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及其它成分組成，而這些纖維組分被大量阿魏酸酯鍵交聯(lián)，形成了極其復雜的結(jié)構，抑制了多糖的降解，不利于青貯發(fā)酵，同時木質(zhì)纖維素還是影響反芻動物消化的重要因素之一。青貯時添加降解細胞壁的酶（如纖維素酶或阿魏酸酯酶）可以有效提高纖維素降解，增加成功青貯率，但由于酶成本較高，不易實際推廣，因此篩選產(chǎn)降解酶的乳酸菌成為新的研究熱點。

纖維素酶是能直接降解纖維素的高效復合酶，為獲得產(chǎn)纖維素酶活較高的乳酸菌，研究者從常年食用高纖維素飼草的西藏牦牛的瘤胃液里篩選得到的屎腸球菌Y83即具有較高的降解纖維素的能力，將其用于狼尾草青貯后，有效提高了青貯水溶性碳水化合物的濃度，處理組具有更高的乳酸濃度和更低的氨基酸、氨態(tài)氮和干物質(zhì)損失［41］；還有學者從新鮮苜蓿中也篩選得到3株纖維降解能力高且具有遺傳穩(wěn)定性的突變菌株［42］，將其用于調(diào)制高纖維含量牧草青貯時，不僅有效降低纖維素含量，還提高了飼料的適口性和發(fā)酵品質(zhì)。而阿魏酸酯酶具有破壞木質(zhì)素和多糖之間醚鍵的活性，能增加多糖與降解酶之間的可及性，間接降解纖維素，近年來篩選利用產(chǎn)阿魏酸脂酶乳酸菌來改善發(fā)酵過程的研究也逐漸增多，如從不同菌源處篩選出來的戊糖片球菌W16、發(fā)酵乳桿菌H2［43］、噬淀粉乳桿菌CGMCC 11056、嗜酸乳桿菌CCTCC AB2010208、香腸乳桿菌CCTCC AB2016237和發(fā)酵乳桿菌CCTCC AB2010204［15］等都能產(chǎn)阿魏酸酯酶，其中A1在25-50℃的溫度和pH5.0-7.0的酸堿度條件下有穩(wěn)定良好的產(chǎn)阿魏酸酯酶能力，用A1能使玉米秸稈青貯料中有更的高乳酸含量和更低的pH、木質(zhì)纖維素含量，而將CGMCC 11056、CCTCC AB2010208、CCTCC AB2016237和CCTCC AB2010204作 為 復 合添加劑青貯玉米秸稈使得飼料pH值下降的更低，乳酸菌數(shù)量和乳酸含量明顯提高，還有研究發(fā)現(xiàn)在狼尾草青貯時添加產(chǎn)阿魏酸酯酶乳酸菌也能有效提高纖維素降解率和青貯品質(zhì)［44］。上述結(jié)果表明，產(chǎn)阿魏酸酯酶和纖維素酶乳酸菌能有效提高木質(zhì)纖維素原料的降解率，促進青貯發(fā)酵，為開發(fā)提高青貯飼料品質(zhì)和消化率添加劑提供了新目標，極具應用潛力。

3.2 益生功能的乳酸菌

部分青貯飼料里存在有害細菌產(chǎn)生的一些有害毒素，動物不斷食用會導致體內(nèi)毒素逐漸累積，從而誘發(fā)各種疾病。因此降低飼料毒素或添加對動物有益的物質(zhì)，在一定程度上可以起到預防動物疾病和促進動物健康的作用。

近年來，有學者已經(jīng)開始篩選一些能結(jié)合或降低飼料毒素或產(chǎn)生有益物質(zhì)的新型益生乳酸菌，如Niderkorn 等［45］篩選出的鏈球菌和腸球菌就能結(jié)合鐮刀菌毒素，將其添加到鐮刀菌毒素污染的玉米青貯飼料中能起到一定的解毒作用，有助于減少動物進食后體內(nèi)積累的毒性；另外，還有研究人員從玉米青貯篩選得到的干酪乳桿菌L30，能結(jié)合49.2%黃曲霉毒素［46］；從玉米和油菜草中篩選得到的鼠李糖乳桿菌753［32］在濕熱條件下能抑制黃曲霉毒素B1的積累；而從玉米青貯飼料中分離到的植物乳桿菌CAAS18008能降低血清低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇和肝臟總膽固醇水平，應用潛力巨大［47］。丙二醇是預防和治療奶牛酮病最有效辦法，但直接使用丙二醇適口性較差、成本高，李雁冰［48］從青貯玉米窖中篩選得到產(chǎn)丙二醇的布式乳桿菌，將其添加到青貯玉米中后飼喂發(fā)現(xiàn)，奶牛健康有明顯改善，其雖未能直接影響奶牛酮病，但為通過在青貯中添加產(chǎn)生對動物有益物質(zhì)的益生乳酸菌種促進動物健康和降低養(yǎng)殖成本提供了新思路，在未來應該更加重視益生特性乳酸菌的篩選利用。

表1詳細列出了近幾年國內(nèi)外篩選出的部分優(yōu)良青貯乳酸菌種，包括菌種來源、類型、主要優(yōu)勢等，以期為后續(xù)優(yōu)良乳酸菌分離篩選及應用提供參考和借鑒。

表1 近幾年國內(nèi)外篩選出的部分優(yōu)良青貯乳酸菌Table 1 Excellent lactic acid bacteria screened at home and abroad in recent five years

4 前景與展望

近年來人們已從各類植物原料表面、青貯飼料中、傳統(tǒng)發(fā)酵食品里等多種菌源處篩選了許多優(yōu)良特性的乳酸菌株，有效解決了部分原料附著的有益菌種數(shù)量少、活性低和生理特性差的問題。同時各類優(yōu)良乳酸菌的分離篩選與應用，為更多商業(yè)菌劑的開發(fā)奠定了基礎，而且相比于一些的化學添加劑來說，乳酸菌制劑還具有無毒無害、安全廉價的優(yōu)勢，現(xiàn)在越來越受到人們的青睞，市場需求進一步擴大，發(fā)展前景更加廣闊。雖然目前取得了一定的成績，但是相對發(fā)達國家來說，我國還有許多不足之處，因此，在今后的研究中，更應該加大科研投入力度，不斷發(fā)掘與分離篩選出更多具有優(yōu)良特性、新型功能的乳酸菌株并探究其對青貯發(fā)酵的影響、深入探索乳酸菌在青貯中的深層作用機制以及其與不同菌種之間的互作網(wǎng)絡和作用機理、優(yōu)化組合不同菌種和確立配伍禁忌、加快開發(fā)更多適合特殊地區(qū)的優(yōu)良乳酸菌添加劑、建立地方性優(yōu)良青貯乳酸菌種資源庫、開發(fā)質(zhì)量穩(wěn)定種類齊全的通用商業(yè)乳酸菌劑，為青貯產(chǎn)業(yè)添加劑的發(fā)展奠定堅實的基礎，促進青貯產(chǎn)業(yè)更好、更快的發(fā)展。