婦炎凈片中氯化兩面針堿含量測定方法改進

廖玉群，康志華，付向紅，楊雷，熊家偉

江西藥都仁和制藥有限公司，江西 樟樹 331200

婦炎凈片處方由當歸、雞血藤、苦玄參、地膽草、菥蓂、五指毛桃、橫經席、兩面針、柿葉九味組成，具有清熱祛濕，調經止帶之功效，用于濕熱蘊結所致的帶下病、月經不調、痛經；慢性盆腔炎、附件炎、子宮內膜炎等證。方中兩面針具有祛風通絡，滲濕止痛，抗炎抗菌等活性［1］。本品為江西藥都仁和制藥有限公司擬進行二次開發(fā)的重點產品之一，現執(zhí)行國家標準YBZ13472005-2009Z，標準中已有苦玄參、兩面針、地膽草、雞血藤的薄層鑒別，以及氯化兩面針堿的含量測定，其中氯化兩面針堿的含量規(guī)定每片中不得少于0.08 mg；而市場上秦皇島皇威制藥有限公司的同品種氯化兩面針堿的含量規(guī)定每片中不得少于0.22 mg（執(zhí)行國家藥品標準YBZA12312006）。故在二次開發(fā)中，為進一步提高產品質量及質量的可控性，對本品中氯化兩面針堿的含量及其測定方法進行了研究，對原標準含量測定方法進行了改進，改進后的方法操作簡便，重復性良好，結果準確，具有專屬性；同時提高了氯化兩面針堿的內控含量指標，由原標準中每片不少于0.08 mg，提高為每片不少于0.20 mg。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：島津LC-20AD、安捷侖1260 Ⅱ；電子天平：CP224S 賽多利斯（d=0.1 mg）及CP225D（d=0.01 mg、0.1 mg）。

1.2 試藥

氯化兩面針堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110848-201802，含量以91.0%計，使用前不需干燥處理）；婦炎凈片樣品（由江西藥都仁和制藥有限責任公司提供，批號：191001、191002、191003、200301、200302、200303、200801、200802、200901、210301）；

乙腈為色譜純（購自美國天地公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 原注冊標準方法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水-三乙胺（23∶77∶0.3）（用磷酸調pH 值為3.0）為流動相；檢測波長為328 nm。理論板數按氯化兩面針堿峰計算應不低于2 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取氯化兩面針堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含5 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取重量差異項下的樣品，研細，取約2.0 g，精密稱定，精密加入1%鹽酸甲醇溶液50 mL，穩(wěn)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用1%鹽酸甲醇溶液補足重量，濾過，精密吸取續(xù)濾液10 mL，過中性氧化鋁柱（100-200目，10 g，內徑1.5 cm），用甲醇50 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

在大量的生產實踐中發(fā)現，本法重現性不理想，影響因素較多，結果偏差較大，加樣回收率偏低，不能真實反映出氯化兩面針堿的含量。

2.2 改進后的方法

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗［2-7］以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈：0.02 mol/L KH2PO4（22∶78）；檢測波長為328 nm。理論板數按氯化兩面針堿峰計算應不低于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取氯化兩面針堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備［8-9］取重量差異項下的樣品，研細，取約1.0 g，精密稱定，精密加入1%鹽酸甲醇溶液50 mL，穩(wěn)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用1%鹽酸甲醇溶液補足重量，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，用稀鹽酸調pH 1～2 后，用三氯甲烷振搖提取3 次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用甲醇使溶解，定量轉移至25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.5 分析方法確認 按照《中國藥典》2020 年版四部通則9101 藥品質量標準分析方法驗證指導原則，選取線性關系、專屬性、定量限、回收率、精密度、耐用性、穩(wěn)定性作為確認指標，對改進后的分析方法進行了確認，結果如下。

線性關系考察：以氯化兩面針堿的濃度（μg/mL）為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得回歸方程Y=46.869X-2.162，相關系數r=0.999 9（n=6）。氯化兩面針堿質量濃度在2.06～51.50 μg/ mL范圍內與峰面積線性良好。

專屬性試驗：色譜圖中，氯化兩面針堿能夠較好地分離，保留時間適中，陰性無干擾，專屬性好。

精密度試驗：取氯化兩面針堿對照品溶液（濃度為20.60 μg/ mL），連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，結果的RSD 為0.66%（n=6），小于2%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：按供試品溶液制備方法制成供試品溶液（批號191001），同時取氯化兩面針堿對照品溶液（20.60 μg/ mL），分別在放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣，測定峰面積，結果的RSD 為1.3%（n=8），表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號191001）6 份，按正文中含量測定項下方法試驗，測定氯化兩面針堿的含量，結果6 份樣品所測得氯化兩面針堿平均含量為289.22 μg/片，RSD 為1.6%（n=6），表明方法重復性良好。

定量限：當信噪比為10∶1 時，氯化兩面針堿的濃度為20 ng/mL。

圖1 高效液相色譜圖：A.陰性樣品；B.供試品；C.對照品

2.3 原注冊標準方法及改進后的方法對比

取樣品（批號191001），分別采用原注冊標準方法及改進后的方法，進行精密度、加樣回收率以及耐用性試驗，測定氯化兩面針堿的含量，檢測結果匯總見表1～3。

表1 精密度試驗結果對比（μg/片）

表2 加樣回收率試驗結果對比（%）

表3 耐用性試驗結果對比（μg/片）

結果，原注冊標準方法精密度、加樣回收試驗及耐用性試驗的RSD 分別為1.9%、3.3%和1.9%，改進后方法的精密度、加樣回收試驗及耐用性試驗的RSD 分別為0.4%、0.7%和0.3%，表明改進后的方法較原方法的精密度、準確度及重現性更理想，原方法加樣回收率偏低，改進后的方法平均加樣回收率為99.5%，表明結果準確，更能真實地反應出本品中氯化兩面針堿的含量，可用于本品的質量控制。

3 樣品測定

取本品，分別按原方法及改進后的方法測定氯化兩面針堿的含量，改進后的方法檢測的氯化兩面針堿的含量均比原方法檢測結果高；考慮到不同產地的兩面針中氯化兩面針堿的含量有高有低［10］，擬將氯化兩面針堿的含量由每片不得少于0.08 mg，提高至每片不得少于0.20 mg。檢測結果見表4。

表4 10批樣品中氯化兩面針堿的含量（μg/ 片）

4 討論

4.1 流動相的選擇

氯化兩面針堿屬苯駢菲喧類生物堿，其結構中堿性氮原子與固定相未鍵臺酸性硅醇基的相互作用，使得色譜峰的展寬拖尾，峰漂移及峰對稱性差，導致分離效能低。故對比了在流動相中加添加緩沖鹽及有機胺改性劑的效果，結果乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（22∶78）的效果優(yōu)于乙腈-水-三乙胺（23∶77∶0.3）（用磷酸調pH 值為3.0），況且三乙胺對色譜柱的損害不易逆轉，故選擇采用乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（22∶78）為流動相。

4.2 檢測波長的選擇

氯化兩面針堿對照品溶液及供試品溶液在271 nm及328 nm 處均有吸收峰，在328 nm 下的色譜圖中雜質干擾峰稍少，故仍選取328 nm 作為檢測波長，不做修訂。

4.3 供試品溶液的制備

修訂的方法采用1%的鹽酸酸化的甲醇進行回流提取，可以使游離的兩面針堿結合成為無機酸鹽，從而能夠提高氯化兩面針堿的提取率；但同時使得提出的雜質也增多；大多數游離生物堿都是親脂性的，故甲醇液蒸干后，加水使溶解調pH1～2,再用三氯甲烷萃取，以達到分離純化的目的。原方法中采用通過中性氧化鋁柱進行分離純化，結果，在去除雜質的同時，將目標成分氯化兩面針堿同時損失了一部分，造成檢測結果比真實含量偏低，結果不準確。

試驗中，對各試驗條件進行了優(yōu)化篩選，如不同提取溶劑、回流提取時間、萃取次數、流動相比例等，結果以正文條件為佳。所建立的方法操作簡便，專屬性強，重復性理想，結果準確，優(yōu)于原方法，能真實地反應本品中氯化兩面針堿的含量?？捎糜趮D炎凈片的質量控制。