miR-370-3p靶向STAT3調(diào)控喉癌細(xì)胞放射敏感性的分子機(jī)制研究

馬俊 嚴(yán)仁純 吳禮鋒 王傳喜 黃靜江 李姚 左娜 吳成 張程林

miRNA為長(zhǎng)度在18～24個(gè)核苷酸的保守短鏈非編碼RNA，其在各種腫瘤中均具調(diào)節(jié)作用[1]，其中包括miR-370-3p。有研究報(bào)道，miR-370-3p在喉癌發(fā)揮抑癌基因的作用，但其調(diào)控機(jī)制尚未十分清楚。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是許多致癌信號(hào)傳導(dǎo)途徑的會(huì)聚點(diǎn)，在腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞中組成型激活[2，3]?；罨腟TAT3抑制針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫激活所必需的介質(zhì)的表達(dá)，STAT3活性促進(jìn)免疫抑制因子的產(chǎn)生，所述免疫抑制因子在不同的免疫細(xì)胞亞群中激活STAT3，改變基因表達(dá)程序，從而抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答[4-6]。在腎母細(xì)胞瘤中STAT3可通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-370表達(dá)而下調(diào)WTX發(fā)揮抑制腎母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的作用[7]。但miR-370-3p與STAT3在喉癌中的作用關(guān)系尚未清晰。本課題研究擬以喉癌細(xì)胞Hep-2為研究對(duì)象，檢測(cè)喉癌組織和癌旁正常組織中miR-370-3p和STAT3的表達(dá)，觀察過(guò)表達(dá)miR-370-3p、敲減STAT3和過(guò)表達(dá)STAT3對(duì)Hep-2細(xì)胞放射敏感性的影響，揭示其機(jī)制可能與miR-370-3p靶向STAT3有關(guān)，這將為增強(qiáng)喉癌放射治療的效果提供依據(jù)。

材料與方法

1 材料

本研究的組織標(biāo)本來(lái)源于皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科自2017年3月～2018年6月期間收治并手術(shù)治療的喉癌患者，術(shù)中切除喉癌及癌旁組織標(biāo)本共39件。本研究上報(bào)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)并批準(zhǔn)，所有喉癌患者及家屬均簽署知情同意書。喉癌細(xì)胞Hep-2購(gòu)于ATCC；LipofectamineTM2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)于大連Takara公司；MTT、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清都購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；RIPA蛋白裂解液、ECL發(fā)光液和SDS-PAGE試劑盒都購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；Annexin VFITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；PVDF膜購(gòu)于德國(guó)公司。

2 方法

含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液用于培養(yǎng)Hep-2，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞處理與分組

待Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，消化收集細(xì)胞后接種到6孔板中37oC、5%CO2培養(yǎng)24h。取各轉(zhuǎn)染物（miR-370-3p mimics、miR-con、si-STAT3、si-con、pcDNA-STAT3、pcDNA、miR-370-3p+pcDNA、miR-370-3p+pcDNA）后用Opti-MEM對(duì)轉(zhuǎn)染物進(jìn)行稀釋，使其終濃度為20nM，混勻，室溫孵育5min。將6孔板中的培養(yǎng)液換為無(wú)血清培養(yǎng)基，分別向各組細(xì)胞中加入Lipo 2000和轉(zhuǎn)染物（分組：miR-370-3p組、miR-con組、si-STAT3組、si-con組、pcDNASTAT3組、pcDNA組、IR+miR-370-3p+pcDNA組、IR+miR-370-3p+pcDNA STAT3組），37°C培養(yǎng)4-6 h；倒掉無(wú)血清培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入新鮮培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)48h，使用Siemens Primus直線加速器6MV高能X線室溫照射，劑量率為3Gy/min，以0Gy、2Gy、4Gy、6Gy垂直照射10cm×10cm范圍內(nèi)的Hep-2細(xì)胞,在放射照射48h后，用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染的效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1.2.2各組細(xì)胞和研磨組織樣品，按照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書中要求，提取RNA進(jìn)行定量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書中操作合成cDNA。再按qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書中要求，進(jìn)行miR-370-3p和STAT3檢測(cè)。用2-△△Ct計(jì)算miR-370-3p和STAT3的表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

取1.2.2各組細(xì)胞和研磨組織樣品，加裂解液，冰上裂解30min。12000rpm離心10min。取上清液置于EP管中，加5×SDS上樣緩沖液，沸水中煮沸10 min。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉膜2h，洗膜，加Ⅰ抗，4℃過(guò)夜，洗膜，加入Ⅱ抗，4℃2h。加入發(fā)光液，曝光。

隨著國(guó)家鐵路網(wǎng)建設(shè)與城市發(fā)展，穿越城區(qū)的部分鐵路將通過(guò)外遷等方式重新發(fā)揮新的活力。與此同時(shí)原鐵路走廊卻逐步成為城市發(fā)展的一道“裂痕”。本文在對(duì)廢棄鐵路沿線問(wèn)題剖析的基礎(chǔ)上，結(jié)合鐵路再利用模式提出了鐵路沿線地區(qū)“面—線—點(diǎn)”的交通優(yōu)化策略，并以南京寧蕪鐵路進(jìn)行了實(shí)例分析，以期通過(guò)多種交通方式系統(tǒng)融合、沿線地區(qū)交通織補(bǔ)以及重要節(jié)點(diǎn)精細(xì)化設(shè)計(jì)與控制等策略方法，實(shí)現(xiàn)廢棄鐵路沿線地區(qū)交通系統(tǒng)的優(yōu)化與提升。

2.5 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)

將1.2.2各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用500uL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，依次加入5uL的Annexin V-/FITC和PI，混勻，室溫，避光靜置15min。流式細(xì)胞儀分析測(cè)定的結(jié)果。細(xì)胞的凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品均重復(fù)3次。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1.2.2各組細(xì)胞，按試劑盒技術(shù)手冊(cè)中要求進(jìn)行操作。psiCHECK2-STAT3-3′UTR WT和psiCHECK2-STAT3-3′UTR MUT的表達(dá)作為對(duì)照，psiCHECK2載體以螢火蟲熒光素酶活性作為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染24h，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。螢火蟲熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度和海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度的比值，即反映miR-370-3p和STAT3的結(jié)合力。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 在喉癌組織中miR-370-3p低表達(dá)和STAT3高表達(dá)

結(jié)果如表2所示，與Normal組相比，Tumor組miR-370-3p表達(dá)顯著降低，STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高（圖1）（P＜0.05）。

圖1 檢測(cè)喉鱗癌組織中STAT3的表達(dá)

表2 檢測(cè)喉鱗癌組織中miR-370-3p和STAT3的表達(dá)（±s，例=3）

表2 檢測(cè)喉鱗癌組織中miR-370-3p和STAT3的表達(dá)（±s，例=3）

*P＜0.05

Groups miR-370-3p STAT3 mRNA STAT3 Normal 1.00±0.08 1.01±0.07 0.45±0.05 Tumor 0.36±0.04* 2.47±0.18* 0.84±0.07*t 12.394 13.094 7.853 P 0.000 0.000 0.001

2 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后miR-370-3p的表達(dá)情況

提取各組細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-370-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-370-3p后，細(xì)胞中miR-370-3p表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（包括Control組和miR-con組；P＜0.001）。相反的，轉(zhuǎn)染anti-miR-370-3p后，細(xì)胞中miR-370-3p表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。由此證明，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功（圖2）。

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

3 過(guò)表達(dá)miR-370-3p可增加喉癌細(xì)胞的放療敏感性

結(jié)果如表3所示，與miR-con組相比，miR-370-3p組喉癌細(xì)胞在4Gy、6Gy劑量下存活分?jǐn)?shù)顯著降低（P＜0.05）。單擊多靶模型細(xì)胞存活曲線擬合結(jié)果為：miR-con組、miR-370-3p組D0(Gy)、Dq(Gy、N、SF2、k分 別 為2.681、2.162、2.240、0.763、0.373；1.233、1.054、2.350、0.404、0.811，如表4。

表3 檢測(cè)喉癌細(xì)胞增殖（±s，例=3）

表3 檢測(cè)喉癌細(xì)胞增殖（±s，例=3）

*P＜0.05

miR-con 1.00±0.09 0.724±0.088 miR-370-3p 1.02±0.07 0.413±0.048 t 0.304 5.374 P 0.776 0.006 0.423±0.076 0.092±0.018*7.341 0.002 0.185±0.017 0.021±0.003*16.455 0.000 Groups 細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)0Gy 2Gy 4Gy 6Gy

表4 單擊多靶模型細(xì)胞存活曲線擬合結(jié)果

4 過(guò)表達(dá)miR-370-3p對(duì)放射照射后喉癌細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果如表5所示，與IR+miR-con組相比，IR+miR-370-3p組喉癌細(xì)胞凋亡率顯著升高（圖3）（P＜0.05）。

圖3 檢測(cè)喉癌細(xì)胞凋亡

表5 檢測(cè)喉癌細(xì)胞凋亡率（±s，例=3）

表5 檢測(cè)喉癌細(xì)胞凋亡率（±s，例=3）

*P＜0.05

Groups Apoptosis rate(%)IR+miR-con 8.98±0.92 IR+miR-370-3p 29.43±3.18*t 10.700 P 0.000

5 miR-370-3p靶向STAT3

應(yīng)用miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-370-3p和STAT3 3′UTR存在的結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)；雙熒光素酶活性檢測(cè)的結(jié)果顯示，同miR-NC組相比較，miR-370-3p組WT-STAT3細(xì)胞中熒光活性顯著下降，而MUT-STAT3細(xì)胞中熒光活性則不受影響（表6）；同miR-NC組相比較，miR-370-3p組細(xì)胞中STAT3的表達(dá)水平顯著下降；同anti-miR-NC組相比較，anti-miR-370-3p組細(xì)胞中STAT3的表達(dá)水平顯著提高（圖4B，表7）（P＜0.05）。

圖4 miR-370-3p靶向STAT3的序列信息

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，例=3）

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，例=3）

*P＜0.05

Groups miR-con miR-370-3p tP WT-STAT3 1.00±0.09 0.42±0.05*9.757 0.001 MUT-STAT3 1.01±0.07 0.97±0.09 0.608 0.576

表7 STAT3調(diào)控miR-370-3p的表達(dá)（±s，例=3）

表7 STAT3調(diào)控miR-370-3p的表達(dá)（±s，例=3）

同miR-con組比，*P＜0.05；同anti-miR-con組比，#P＜0.05。

Groups miR-con miR-370-3p anti-miR-con STAT3 0.79±0.08 0.23±0.03*0.77±0.07 anti-miR-370-3p 1.39±0.11#F 110.930 P 0.000

6 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后STAT3的表達(dá)情況

提取各組細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中STAT3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA STAT3后，細(xì)胞中STAT3表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（包括Control組和pcDNA組；P＜0.001）。由此證明，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功，如圖5。

圖5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

7 沉默STAT3對(duì)放射照射后喉癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

結(jié)果如表8所示，與IR+si-con組相比，IR+si-STAT3組喉癌細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)顯著降低，在4Gy、6Gy劑量下存活分?jǐn)?shù)顯著降低（P＜0.05），如圖6。

圖6 檢測(cè)沉默STAT3和放射后喉癌細(xì)胞中STAT3

表8 檢測(cè)沉默STAT3和放射后喉癌細(xì)胞增殖和凋亡

8 過(guò)表達(dá)miR-370-3p和過(guò)表達(dá)STAT3對(duì)放射照射后對(duì)喉癌細(xì)胞放療敏感性的影響

結(jié)果如表9所示，與IR+miR-con組相比，IR+miR-370-3p組STAT3蛋白表達(dá)顯著降低（圖5），在4Gy、6Gy劑量下細(xì)胞活性顯著降低；與IR+miR-370-3p+pcDNA組相比，IR+miR-370-3p+pcDNA STAT3組STAT3蛋白表達(dá)顯著升高（圖7），在4Gy、6Gy劑量下細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05）。

圖7 檢測(cè)喉癌細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)

表9 檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-370-3p和 STAT3對(duì)放射后喉癌細(xì)胞增殖和凋亡

討論

大量研究證實(shí)，miRNA參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其是癌癥，其在癌癥中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[8，9]。miR-370-3p在膀胱癌、甲狀腺癌、肺癌、食管癌、喉癌中均出現(xiàn)異常表達(dá)[10-12]。魏明輝等[13]、劉愛學(xué)等[14]在研究喉鱗癌中差異miRNA中均發(fā)現(xiàn)miR-370的表達(dá)水平出現(xiàn)異常降低。Wu等[15]在喉鱗狀細(xì)胞癌的研究中證明了miR-370在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中下調(diào)，F(xiàn)orkhead Box ml（FoxM1）表達(dá)上調(diào)并與miR-370表達(dá)之間存在反向關(guān)系，隨后通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定證實(shí)FoxM1是miR-370的靶標(biāo)，且在Hep2細(xì)胞中恢復(fù)的miR-370表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖，提示miR-370可能通過(guò)下調(diào)FoxM1在喉鱗狀細(xì)胞癌中起腫瘤抑制作用。本研究通過(guò)檢測(cè)喉癌組織中miR-370-3p和STAT3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-370-3p的表達(dá)水平顯著下降，而STAT3的表達(dá)水平顯著提高，與以前的研究結(jié)果相一致。

越來(lái)越多的研究表明miRNA的異常表達(dá)有助于癌癥對(duì)放射治療的敏感性，放射治療是喉癌的重要治療方式，但部分早期喉癌患者對(duì)放療有抗藥性。Zhou等[16]運(yùn)用GeneChip miRNA Array對(duì)放射治療后原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌和復(fù)發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miRNA表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-381在輻射抗性組織和細(xì)胞中下調(diào)，miRNA-381的強(qiáng)制表達(dá)增加了食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的放射敏感性，并促進(jìn)了非侵襲性表型，包括細(xì)胞增殖和遷移減少，且異種植瘤顯示miRNA-381過(guò)表達(dá)降低了腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤異種移植物中對(duì)放射治療的抗性，提示miRNA-381為食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞放射敏感性的關(guān)鍵決定因素。Hu等[17]在喉癌的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染靶向shRNA的survivin后，MTS實(shí)驗(yàn)顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，輻射組的存活率降低，此外，shRNA靶向存活蛋白消除了輻射誘導(dǎo)的G2期阻滯和放大的輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，另外在體內(nèi)shRNA轉(zhuǎn)染還增強(qiáng)腫瘤異種移植物對(duì)放射療法的敏感性，可見喉鱗狀細(xì)胞癌的放射抗性可能與存活蛋白表達(dá)增加有關(guān)，而存活蛋白抑制可能增強(qiáng)喉鱗狀細(xì)胞癌的放射敏感性。存活蛋白與細(xì)胞凋亡相關(guān)，推測(cè)喉鱗狀細(xì)胞癌的放射敏感性也許與喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡相關(guān)。Xu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-24在喉癌中表達(dá)異常降低，過(guò)表達(dá)miR-24可抑制喉癌細(xì)胞生長(zhǎng)，減少集落形成，并增強(qiáng)喉癌的凋亡，上調(diào)miR-24可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡增加喉癌對(duì)輻射的敏感性。本研究檢測(cè)了過(guò)表達(dá)miR-370-3p的喉癌細(xì)胞Hep-2的放射照射的敏感性發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-370-3p可明顯降低Hep-2細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，增強(qiáng)放射照射的敏感性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hep-2細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-370-3p可明顯增強(qiáng)放射照射對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)能力；進(jìn)一步用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明miR-370-3p靶向負(fù)調(diào)控STAT3。

STAT3在腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其可導(dǎo)致誘導(dǎo)腫瘤的惡性行為。因此，STAT3已成為癌癥精準(zhǔn)治療的希望靶標(biāo)[19，20]。王海茹等[21]、郭慧等[22]在喉癌的研究中顯示，干擾沉默STAT3可增強(qiáng)順鉑耐藥和抗放療喉癌細(xì)胞的耐藥性和放射治療的敏感性。本研究檢測(cè)了沉默STAT3的Hep-2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，沉默STAT3可降低Hep-2細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，增強(qiáng)放射照射的敏感性和對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)能力；進(jìn)一步研究表明，過(guò)表達(dá)STAT3可逆轉(zhuǎn)miR-370-3p對(duì)Hep-2細(xì)胞放射照射敏感性的增強(qiáng)作用。

綜上所述，miR-370-3p可增強(qiáng)放射照射對(duì)喉癌細(xì)胞的敏感性，其機(jī)制可能與靶向STAT3有關(guān)，為喉癌的治療奠定基礎(chǔ)。