中國優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力敏感基因位點(diǎn)的確定

亓 朔，蘇 浩，許奎元，趙林林，王傳軍，曹建民

柔道項(xiàng)目是一個(gè)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度極大的非周期過程，具有競爭性與高強(qiáng)度間歇性，需要較高的絕對和相對水平的肌肉力量，要求運(yùn)動(dòng)員在4～5 min內(nèi)多次發(fā)動(dòng)進(jìn)攻，瞬間完成復(fù)雜的技術(shù)動(dòng)作（Franchini et al.，2011）。選材是支撐競技體育國際競爭力的九大支柱之一，也是決定一個(gè)國家競技運(yùn)動(dòng)水平優(yōu)劣不可或缺的重要因素（黎涌明等，2018）。我國柔道項(xiàng)目的選材經(jīng)歷過3個(gè)階段，自然選材、經(jīng)驗(yàn)選材、科學(xué)選材，目前以科學(xué)選材為主，主要是結(jié)合形態(tài)學(xué)、身體素質(zhì)、生理生化、心理等指標(biāo)進(jìn)行選材（何鋼等，2015）。

近年，隨著分子遺傳學(xué)和基因檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，通過基因技術(shù)對優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行基因位點(diǎn)篩選，從而為早期運(yùn)動(dòng)員的培養(yǎng)提高精準(zhǔn)性，提高運(yùn)動(dòng)員成才率。

通過在 Pubmed、Web of Science、SPORTDiscus、Med‐line等外文網(wǎng)站搜索“judo”“gene”“explosive force”等關(guān)鍵詞確定與爆發(fā)力相關(guān)的位點(diǎn)作為候選基因位點(diǎn)，位點(diǎn)選擇依據(jù)：所選項(xiàng)目特點(diǎn)與柔道項(xiàng)目類似且在國內(nèi)外研究結(jié)果為正相關(guān)。一項(xiàng)文獻(xiàn)檢索（1997－2015年）顯示，至少有120個(gè)遺傳標(biāo)記與優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員狀態(tài)相關(guān)，其中包括77個(gè)與耐力相關(guān)的遺傳標(biāo)記和43個(gè)與爆發(fā)力相關(guān)的遺傳標(biāo)記，值得注意的是，在43個(gè)與爆發(fā)力相關(guān)的遺傳標(biāo)記中，ACE基因rs4646994位點(diǎn)、ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)和PPARα基因rs4253778位點(diǎn)在3項(xiàng)或3項(xiàng)以上的研究中被證明與優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員的爆發(fā)力顯著相關(guān)（Ahmetov et al.，2015）。因此，以上3個(gè)位點(diǎn)可納入本研究的候選基因位點(diǎn)。楊若愚（2017）在對我國優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力相關(guān)基因多態(tài)性及其預(yù)測模型的研究中發(fā)現(xiàn)，ACTN3基因rs1815739、ADBR3基因rs4994、CNTFR基因rs3808871和VDR基因rs7975232位點(diǎn)被證明與中國優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力存在相關(guān)。因此，將ADBR3基因rs4994、CNTFR基因rs3808871和VDR基因rs7975232位點(diǎn)納入本研究的候選基因位點(diǎn)。國外文獻(xiàn)在對CNTFR基因與VDR基因中常選取多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究，且結(jié)果不一，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，將CNTFR基因rs41274853與VDR基因rs2228570位點(diǎn)納入本研究的候選基因位點(diǎn)（Bahat et al.，2010；Bjork et al.，2019；Hong et al.，2014；Massidda et al.，2015；Miyamo‐to-Mikami et al.，2016）。

綜上，本研究選用如下候選基因位點(diǎn)：ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)、ADBR3基因rs4994位點(diǎn)、CNTFR基因rs3808871和rs41274853位點(diǎn)、PPARα基因rs4253778位點(diǎn)、VDR基因rs7975232和rs2228570位點(diǎn)及ACE基因rs1799752位點(diǎn)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

研究對象分為兩組：優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員組與普通組，將54名漢族優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員組成的優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員組命名為J組（165.6±3.7 cm，22.±3.4歲，訓(xùn)練年限9.63±3.30年），180名漢族普通大學(xué)生組成的普通組命名為C組（166.8±4.5 cm，20.4±2.5歲）。J組從國家隊(duì)以及地方省隊(duì)選取，要求運(yùn)動(dòng)員等級為國家健將或國際健將，民族為漢族，C組從北京體育大學(xué)本科生中隨機(jī)招募，要求無任何專業(yè)隊(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練經(jīng)歷，民族為漢族。

1.2 DNA樣本的采集

本實(shí)驗(yàn)方案通過北京體育大學(xué)道德倫理審查專家委員會(huì)的審查（審批編號：2019020H）。受試者的采樣均為無創(chuàng)的唾液采集，在采樣前受試者閱讀并填寫知情同意書。

取口腔脫落細(xì)胞：取樣前用清水漱口，為了避免樣本不被污染，漱口后勿進(jìn)食飲料和零食等，漱口后30 min由測試人員拿口腔拭子取樣，在口腔左右內(nèi)壁涂抹10次，取樣時(shí)要注意力度稍大，取樣后置于4℃保存。

1.3 DNA的提取

取樣后按照口腔試劑盒中的提取步驟進(jìn)行提取。

1.4 基因分型

采用SNaPshot技術(shù)對樣本進(jìn)行SNP分型。通過反應(yīng)，引物延伸一個(gè)堿基即終止，再經(jīng)測序儀檢測，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知插入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型（圖1）。

圖1 SNapshot原理Figure 1. SNapshot Principle

1.4.1 PCR引物設(shè)計(jì)合成

表1 各基因位點(diǎn)引物名稱與引物序列Table 1 Primer Name and Primer Sequence for Each Gene Locus

依據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物。

1.4.2 擴(kuò)增反應(yīng)、延伸反應(yīng)及純化

擴(kuò)增反應(yīng)、延伸反應(yīng)及純化等步驟參考3730XL儀器操作指南進(jìn)行。

1.4.3 基因分型結(jié)果

每個(gè)位點(diǎn)對應(yīng)的位置上如果出現(xiàn)單一的一個(gè)較長的波峰，說明這個(gè)基因位點(diǎn)的基因型為純合型，如果出現(xiàn)兩個(gè)連續(xù)較短的波峰，說明這個(gè)基因位點(diǎn)的基因型為雜合型（圖2）。

圖2 某一樣本SNP基因分型結(jié)果Figure 2. Results of SNPGenotyping of a Sample

1.5 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

每組的基因分型結(jié)果均進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，當(dāng)P＞0.05時(shí)，說明基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明研究對象具有群體代表性。每組的基因型與等位基因分布數(shù)據(jù)均采用卡方檢驗(yàn)，將P＜0.05定義為兩組的基因型分布與等位基因分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 各位點(diǎn)基因分型結(jié)果的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

54名優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員與180名普通大學(xué)生各基因位點(diǎn)經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg平衡定律（表2），表明研究對象具有群體代表性（P＞0.05）。

表2 兩組各位點(diǎn)基因分型結(jié)果的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Genotyping Results of Each Locus in Two Groups Test‐ed by Hardy-Weinberg Equilibrium Test

2.2 各位點(diǎn)基因型分布結(jié)果和等位基因分布結(jié)果

ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)中J組CC基因型頻率顯著高于對照組（P＜0.05；表3），C等位基因頻率顯著高于對照組（P＜0.05）；CNTFR基因rs41274853位點(diǎn)中J組GG基因型頻率顯著高于對照組（P＜0.05），G等位基因頻率顯著高于對照組（P＜0.05）。其余基因位點(diǎn)中基因型頻率與等位基因頻率在J組和C組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 兩組間各位點(diǎn)基因型分布結(jié)果和等位基因分布結(jié)果的統(tǒng)計(jì)顯著性

ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)基因型分布與等位基因分布在優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員和普通人之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；表4）；CNTFR基因rs41274853位點(diǎn)基因型分布與等位基因分布在優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員和普通人之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 分析與討論

3.1 ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)與爆發(fā)力的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員（健將級及以上）的ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)基因型分布、等位基因分布與C組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；表4），J組中CC基因型頻率顯著高于C組，且CC基因型在優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員中的分布頻率高于CT、TT基因型頻率（表3），表明該基因多態(tài)性位點(diǎn)與優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員存在關(guān)聯(lián)。

表3 兩組各位點(diǎn)基因型分布結(jié)果和等位基因分布結(jié)果Table 3 Results of Genotype Distribution andAllele Distribution of Each Locus in Two Groups

表4 兩組間（J vs.C）各位點(diǎn)基因型分布與等位基因分布結(jié)果的統(tǒng)計(jì)顯著性Table 4 Statistical Significance of Results of Genotype Distribution andAllele Distribution of Each Locus between Two Groups（J vs.C）

Rodriguez-Romo等（2013）研究該位點(diǎn)時(shí)未發(fā)現(xiàn)西班牙精英男性柔道運(yùn)動(dòng)員與普通人之間存在差異，得出ACTN3基因rs1815739多態(tài)性與優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員競技狀態(tài)不顯著相關(guān)。同樣是以優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員為研究對象，可能是因?yàn)榛蚨鄳B(tài)性存在地域、人種的差異，從而引起結(jié)果不一致。

Kikuchi等（2012）對日本優(yōu)秀摔跤運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行ACTN3基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)ACTN3基因多態(tài)性與日本優(yōu)秀摔跤運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)有關(guān)。該研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，可以看出即便兩個(gè)研究中的實(shí)驗(yàn)對象民族不同，但兩個(gè)項(xiàng)目的特點(diǎn)類似，均是以高強(qiáng)度對抗的間歇運(yùn)動(dòng)，且以爆發(fā)力為主的項(xiàng)目。

楊曉琳等（2010）與李燕春等（2016）在研究該位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)CC基因型可作為中國北方漢族舉重運(yùn)動(dòng)員與中、長距離游泳運(yùn)動(dòng)員選材的分子標(biāo)記。楊若愚（2017）在中國優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力相關(guān)基因多態(tài)性及其預(yù)測模型的研究中發(fā)現(xiàn)，ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)與我國優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員的爆發(fā)力存在相關(guān)。由此可見，在以我國優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員為研究對象時(shí)，上述研究與本研究結(jié)果保持一致，因此，在選擇研究對象時(shí)，要保證優(yōu)秀組與普通組的民族、地區(qū)來源相一致。鑒于全國范圍內(nèi)柔道項(xiàng)目健將數(shù)量較少，本研究在進(jìn)行兩組比較時(shí)，保證民族相一致（均為漢族），從而減小誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

結(jié)合該位點(diǎn)發(fā)展趨勢來看，已被研究證明該位點(diǎn)與優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員的爆發(fā)力存在關(guān)聯(lián)。有研究表明，ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)表現(xiàn)的CC基因型與C等位基因在速度和力量素質(zhì)中占優(yōu)勢（楊若愚，2017；Ahmetov et al.，2015；Moran et al.，2007；Vincent et al.，2007；Yang et al.，2017）。上述結(jié)果的一致性表明，該位點(diǎn)對肌肉的收縮速度、爆發(fā)力有一定影響。研究表明，ACTN3基因指導(dǎo)合成的α-輔肌動(dòng)蛋白-3僅存在于快肌纖維中，α-輔肌動(dòng)蛋白-3在肌肉快速收縮過程中對其進(jìn)行保護(hù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，含有α-輔肌動(dòng)蛋白-3的小鼠模型中無氧代謝酶活性較高（Ma‐carthur et al.，2007；Vincent et al.，2007）。

柔道屬于高強(qiáng)度的對抗運(yùn)動(dòng)，代謝途徑以無氧代謝為主，爆發(fā)力直接影響比賽成績。本研究證明了基因型CC與等位基因C對于柔道項(xiàng)目是優(yōu)勢基因型，因此，在進(jìn)行運(yùn)動(dòng)員選材時(shí)可采用該方法輔助運(yùn)動(dòng)員選材，從而提高運(yùn)動(dòng)員的成才率，為后續(xù)基因選材提供理論依據(jù)以及數(shù)據(jù)支持。

3.2 CNTFR基因rs41274853位點(diǎn)與爆發(fā)力的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員（健將級及以上）的CNTFR基因rs41274853位點(diǎn)基因型分布、等位基因分布與C組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；表4），J組中GG基因型頻率顯著高于C組，且GG基因型在優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員中的分布頻率高于GA、AA基因型頻率（表3），表明該基因多態(tài)性位點(diǎn)與優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員存在關(guān)聯(lián)。

Miyamoto等（2016）以日本精英運(yùn)動(dòng)員為研究對象時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因位點(diǎn)多態(tài)性與國際短跑力量運(yùn)動(dòng)員的力量表型指標(biāo)顯著相關(guān)，研究結(jié)果與本研究結(jié)果保持一致。

本研究結(jié)果與楊若愚（2017）等的研究結(jié)果不一致。原因如下：1）選擇爆發(fā)力項(xiàng)目時(shí)存在一定偏差，分析中國優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力相關(guān)基因多態(tài)性及其預(yù)測模型的研究發(fā)現(xiàn)，在選擇爆發(fā)力項(xiàng)目的優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員時(shí)涵蓋多個(gè)項(xiàng)目（田徑、標(biāo)槍、撐竿跳、跳高、跳遠(yuǎn)等），多樣化的爆發(fā)力項(xiàng)目可能會(huì)造成研究結(jié)果的多樣性；2）研究對象的選擇不夠嚴(yán)謹(jǐn)，分析中國優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力相關(guān)基因多態(tài)性及其預(yù)測模型的研究發(fā)現(xiàn)，對于爆發(fā)力組的人員選取并未控制研究對象的民族一致性，只是保證了人員所從事的項(xiàng)目均是以爆發(fā)力為主的項(xiàng)目，對照組也未保證民族一致；3）優(yōu)秀組與普通組的人數(shù)比例存在一定偏差，分析中國優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力相關(guān)基因多態(tài)性及其預(yù)測模型的研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀組與普通組人數(shù)比例約為1∶1，國內(nèi)外研究在進(jìn)行SNP位點(diǎn)分析比對時(shí)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀組與普通組的人數(shù)比例約為1∶3。因此，本研究在保證爆發(fā)力項(xiàng)目獨(dú)立的基礎(chǔ)上，J組與C組的民族保持一致，J組與C組的人數(shù)比例大約控制在1∶3。未來，尚需研究進(jìn)一步證實(shí)該位點(diǎn)與爆發(fā)力項(xiàng)目優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員之間的關(guān)聯(lián)。

目前，鮮見國內(nèi)關(guān)于該位點(diǎn)與運(yùn)動(dòng)能力的研究，以往的研究表明，CNTF作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子可以營養(yǎng)神經(jīng)和肌肉，與受體結(jié)合后發(fā)揮化學(xué)傳遞作用，從而為大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞的生長和分化提供營養(yǎng)（Fraysse et al.，2000；Gayagay et al.，1998；Guillet et al.，1999）。柔道項(xiàng)目是一項(xiàng)高強(qiáng)度的對抗運(yùn)動(dòng)，肌肉的收縮是在神經(jīng)的調(diào)控下完成的，提高神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性可以增加運(yùn)動(dòng)單位的募集效果，從而動(dòng)員更多的肌纖維參與肌肉的收縮，提高機(jī)體的爆發(fā)力。從該基因影響的生理機(jī)制來看，未來可能是一個(gè)潛在的爆發(fā)力基因位點(diǎn)。因此，CNTFR基因可能是改變肌肉的收縮特性來影響肌肉的性能，同時(shí)，可能也與肌肉的體積相關(guān)，CNTFR基因與運(yùn)動(dòng)員狀態(tài)和肌肉表現(xiàn)關(guān)系的分子機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究證明。值得注意的是，在保證研究對象人數(shù)比例合適的情況下，應(yīng)增加該基因的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析，從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 其他基因位點(diǎn)與爆發(fā)力的關(guān)系

PPARα是調(diào)節(jié)脂質(zhì)、葡萄糖能量平衡，血管炎癥的轉(zhuǎn)錄因子，以及調(diào)節(jié)骨骼肌和心肌脂肪酸的氧化，Petr等（2014）發(fā)現(xiàn)，C等位基因攜帶個(gè)體與捷克精英男性冰球運(yùn)動(dòng)員狀態(tài)相關(guān)。ACE是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶，可以引起心肌細(xì)胞肥大，造成運(yùn)動(dòng)性心肌肥大，從而影響機(jī)體的心血管功能。Papadimitriou等（2016）發(fā)現(xiàn)，AA型的短跑運(yùn)動(dòng)員能夠以更短的時(shí)間完成沖刺，認(rèn)為該型的運(yùn)動(dòng)員具有較好的爆發(fā)力。VDR主要參與維持鈣磷平衡，通過影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相應(yīng)蛋白的合成。

本研究尚未發(fā)現(xiàn)選取的PPARα基因rs4253778位點(diǎn)、ACE基因rs1799752位點(diǎn)、VDR基因rs7975232和rs2228570位點(diǎn)以及ADBR3基因rs4994位點(diǎn)與我國優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力相關(guān)，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)考證。

4 結(jié)論

ACTN3基因rs1815739位點(diǎn)、CNTFR基因rs41274853位點(diǎn)可確定為與我國優(yōu)秀柔道運(yùn)動(dòng)員爆發(fā)力存在關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)，日后可作為基因選材的分子標(biāo)記。