嗜酸乳桿菌LA85對小鼠免疫機能的研究

趙琳 范雅宸 黃子爭 薛峰 張森

基金項目：江蘇省高校面上項目（項目編號：19KJ360017、20KJB550014）;國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（項目編號：201910315034Z）;南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)一流學(xué)科開放課題（項目編號：2020YLXK021）。

作者簡介：趙琳（1999—），女，在讀碩士研究生，研究方向：生物發(fā)酵與轉(zhuǎn)化。

通信作者：張森（1988—），男，副教授，研究方向：工業(yè)微生物。

摘要：目的：研究嗜酸乳桿菌LA85對小鼠免疫機能的影響。方法：將160只雄性小鼠隨機分為4組，即對照組、低、中、高三個劑量組。采用灌胃的方式給予實驗小鼠不同劑量的嗜酸乳桿菌LA85。通過對小鼠平均體重、脾臟和胸腺免疫指數(shù)、細胞免疫、體液免疫、單核-吞噬性細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）活性的評價，探討嗜酸乳桿菌LA85對小鼠免疫機能的影響機制。結(jié)果：與對照組相比，嗜酸乳桿菌LA85低、中、高劑量組能夠顯著提升小鼠的胸腺指數(shù)，嗜酸乳桿菌LA85高劑量組能夠顯著提升小鼠的脾臟指數(shù)。同時能夠顯著提高小鼠的淋巴細胞增殖分化能力、半數(shù)溶血值、巨噬細胞的吞噬能力、NK細胞的細胞活性;嗜酸乳桿菌對小鼠的體重沒有影響。結(jié)論：給予小鼠口服嗜酸乳桿菌LA85可以通過改善細胞免疫和體液免疫功能，從而提高免疫力。

關(guān)鍵詞：嗜酸乳桿菌LA85;免疫機能;小鼠

益生菌是當(dāng)宿主攝入一定量時，能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡來維持宿主消化系統(tǒng)和腸道健康的一類微生物[1-2]。乳酸菌作為一種益生菌，對人類的一些疾病，如炎癥性腸疾病、腸功能障礙和結(jié)腸癌等起到預(yù)防和治療的效果，同時對人體免疫功能也有一定的增強作用[3-6]。乳酸菌細胞通過對食道腸黏膜上皮巨噬細胞和其他宿主黏膜的免疫黏附作用進入人體腸道，刺激機體的免疫系統(tǒng)，通過免疫調(diào)節(jié)趨化因子和巨噬細胞因子的產(chǎn)生，達到不斷增強機體宿主黏膜免疫能力的重要作用[7-8]。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）屬于革蘭氏陽性菌，其在機體內(nèi)可以釋放乙酸和乳酸等物質(zhì)，從而起到抑制有害微生物生長的作用，繼而發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的功能[9-10]。謝文惠[11]研究表明，含嗜酸乳桿菌的復(fù)合益生菌制劑在一定程度上提高了肉雞血清中免疫球蛋白含量，從而增強肉雞機體免疫性能。本實驗使用嗜酸乳桿菌LA85飼喂健康小鼠，以小鼠體重、免疫器官指數(shù)，以及細胞免疫和體液免疫等相關(guān)參數(shù)為評價指標(biāo)[12-14]，探討嗜酸乳桿菌對小鼠免疫能力的影響，為進一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑及實驗動物

SPF級，ICR小鼠，雄性，8 w齡，初始體重18～22 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司;清潔級顆粒鼠糧和清潔級墊料，購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。

嗜酸乳桿菌LA85（1.0×108 CFU/g），微康益生菌（蘇州）股份有限公司;綿羊紅細胞（SRBC）、小鼠淋巴瘤（YAC-1）細胞、豚鼠血清、雞紅細胞，Vitrocell公司;吉姆薩色素染料（Giemsa）、Hanks平衡鹽溶液、SA緩沖液，日本同仁化學(xué)研究所;細胞培養(yǎng)基1640，美國Hyclone公司;碘硝基氯化四氮唑藍（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS），天津市津北精細化工有限公司。碳酸氫鈉、丙酮、甲醇、乳酸鈉、高鐵氰化鉀、氰化鉀、NP40，均為分析純;NAD（-20℃），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

YP5002電子天平，上海佑科有限公司;721型分光光度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司;CT14RD臺式高速冷凍離心機，上海天美儀器有限公司;數(shù)顯式游標(biāo)卡尺0～200 mm，世達工具（上海）有限公司;恒溫水浴鍋，上海一科儀器有限公司;顯微鏡，奧林巴斯（中國）有限公司;潔凈工作臺，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;全自動酶標(biāo)儀，美國伯樂公司。

1.3方法

1.3.1動物分組及飼養(yǎng)方式160只雄性小鼠（ICR），平均體重為（20±2）g，隨機分為4組，每組40只小鼠，分別命名為實驗1組、實驗2組、實驗3組、實驗4組。實驗1組進行測定小鼠體重、免疫器官指數(shù)以及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（SRBC誘導(dǎo)小鼠DTH）;實驗2組進行小鼠體液免疫功能實驗（HC50的測定）;實驗3組進行小鼠單核-吞噬細胞活性抑制實驗（小鼠腹腔巨噬細胞能吞噬及紅細胞實驗）;實驗4組進行NK細胞活性實驗（LDH測定）。在規(guī)范的動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每天給清潔級的顆粒鼠糧和水。在最后1天適應(yīng)性喂養(yǎng)，根據(jù)各實驗組小鼠的體重，將體重相近的10只小鼠分為1組，40只小鼠共分為4組，即對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，開展相關(guān)實驗。

1.3.2嗜酸乳桿菌LA85劑量選擇及給藥方式將嗜酸乳桿菌LA85粉末與去離子水混合，通過磁力攪拌器攪拌，配制成5、10、20 mg/mL的嗜酸乳桿菌溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。每組小鼠于每天上午11：00進行1次灌胃，共灌胃30 d。對照組：灌胃去離子水1 mL。低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃濃度為5、10、20 mg/mL的嗜酸乳桿菌溶液各1 mL。

1.3.3小鼠體重及免疫器官指數(shù)的測定實驗期間，每天稱取小鼠體重，并記錄其體重變化。在灌胃實驗完全結(jié)束后，采用斷頸方式處死小鼠，并對其進行解剖。取出胸腺和脾臟，并迅速對臟器周圍的結(jié)締組織和血液進行清除，并稱重。免疫器官指數(shù)（IOI）按照式（1）進行計算：

IOI（mg/g）=胸腺或脾臟鮮重量（mg）體重（g）（1）

1.3.4小鼠淋巴細胞增殖活性的測定（1）SRBC細胞懸浮液配制：新鮮綿羊血放入無菌錐形瓶中，通過定向搖動，去除綿羊血纖維。之后放入冰箱冷藏（4℃）備用。使用前用生理鹽水離心（2 000 r/min、10 min）洗滌3次，分別配置成濃度為2%、10%的SRBC細胞懸液。（2）致敏：用2%SRBC靜脈免疫，每只小鼠注射0.2 mL。（3）DTH的產(chǎn)生與測定：小鼠經(jīng)過免疫后的4 d，采用游標(biāo)卡尺對其左后足跖部進行測量。之后，對其測量部位進行靜脈免疫，SRBC濃度為20%，注射劑量為20 μL。于24 h后，對其厚度和寬度進行測量[15]。以小鼠足跖的腫脹程度表示淋巴細胞增殖的情況。根據(jù)式（2）計算小鼠的足跖腫脹度：

足跖腫脹度（mm2）=足跖寬度×足跖厚度（2）

1.3.5小鼠血清中溶血素含量的測定（1）SRBC細胞懸浮液制備：按照1.3.4（1）制備。（2）制備補體和都氏試劑：取新鮮豚鼠血清5 mL，加入1 mL SRBC，于4 ℃放置30 min。之后，離心取上清液于-70℃保存?zhèn)溆?。使用前采?倍的SA液稀釋。都氏試劑采用碳酸氫鈉、高鐵氰化鉀和氰化鉀配置。（3）免疫小鼠及分離血清：采用腹腔注射0.2 mL SRBC細胞懸浮液對小鼠進行免疫處理。免疫處理后4～5 d，銅鼓摘除眼球的方式取血，離心（6 000 r/min，4min）分離血清。（4）溶血反應(yīng)：小鼠血清用200倍SA緩沖液稀釋后備用。在11 mL血清中依次加入0.5 mL 10%SRBC和1 mL補體。同時以SA緩沖液為對照管。于水浴鍋（37℃）中反應(yīng)15 min后，冰浴終止反應(yīng)。離心（2 000 r/min，10 min）取上清液1 mL，與3 mL都氏試劑混勻，靜置10 min后，540 nm下測定吸光值。空白采用0.25 mL 10% SRBC和3.75 mL都氏試劑。半數(shù)溶血值（HC50）按照式（3）計算：

HC50=樣品光密度值SRBC半數(shù)溶血時的光密度值×稀釋倍數(shù)（3）

1.3.6小鼠腹腔吞噬細胞吞噬雞紅細胞能力的測定（1）雞紅細胞懸液制備：按照1.3.4（1）方法制備。（2）吞噬功能測定：小鼠腹腔吞噬細胞吞噬能力的檢測按照金鑫等[14]建立的方法。其中SRBC濃度為20%，固定液為丙酮/甲醇溶液（1：1，v/v），染色液為4%的Giemsa-磷酸緩沖液，染色時間為3 min。染色結(jié)束后，無菌水漂洗晾干后鏡檢。吞噬百分率和吞噬指數(shù)按照式（4）計算：

吞噬百分率（%）=吞噬雞紅胞的巨噬細胞數(shù)計數(shù)的巨噬細胞×100;

吞噬指數(shù)=吞噬的雞紅細胞總數(shù)計數(shù)的巨噬細胞數(shù)（4）

1.3.7小鼠NK細胞活性的測定（1）效應(yīng)細胞的制備：在無菌環(huán)境中取出小鼠脾臟，至于Hanks液中，用鑷子對其進行破碎，制備單細胞懸液。單細胞懸液經(jīng)過過濾、洗滌、離心（1 000 r/min，10 min）后，獲得細胞漿。通過加入無菌水使得細胞裂解，繼而加入Hanks液。離心后用含有牛血清（10%）的培養(yǎng)基配置細胞懸液，細胞濃度為2×107個/mL。（2）靶細胞的制備：實驗前1天對靶細胞進行傳代培養(yǎng)。用前采用Hanks液對其洗滌3次，之后用1640培養(yǎng)基稀釋，細胞濃度調(diào)整為4×105個/mL。（3）NK細胞活性檢測：NK細胞活性檢測參照趙宏宇等[16]建立的方法。其中細胞培養(yǎng)時間為4 h，細胞培養(yǎng)液與LDH基質(zhì)液反應(yīng)時間為5 min，檢測波長為490 nm。NK細胞活性（%）按照式（5）計算：

NK細胞活性（%）=反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD最大釋放孔OD-自然釋放孔OD×100%（5）

1.4數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s），樣本之間的平均值比較均采用t檢驗（P<0.05表示有顯著性差異），采用Excel 2020和SPSS 22處理實驗數(shù)據(jù)。

2結(jié)果和分析

2.1嗜酸乳桿菌LA85對小鼠體重的影響

如表1所示，實驗1組為測量免疫器官指數(shù)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)免疫實驗的小鼠;實驗2組為體液免疫實驗的小鼠;實驗3組為單核-吞噬細胞活性實驗的小鼠;實驗4組為NK細胞活性實驗小鼠。結(jié)果顯示，于對照組相比較，各劑量組對小鼠體重增長率無顯著性（P>0.05）影響。這一結(jié)果說明，攝食嗜酸乳桿菌LA85不會影響小鼠體重，可以初步判定LA85為低毒性。

2.2嗜酸乳桿菌LA85對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟指數(shù)通常作為衡量機體免疫系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)[17]。通常情況下，機體免疫功能增強，會伴隨胸腺和脾臟質(zhì)量的增加。因此，免疫器官指數(shù)常被用于判斷機體免疫功能的手段之一。如表2所示，與對照組比較，各劑量組中小鼠的胸腺指數(shù)均有明顯增加（P<0.05）。低、中、高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)分別增加了6.71%、8.74%、13.62%，其中高劑量組與對照組之間存在顯著性差異（P<0.05）。各劑量組小鼠灌胃嗜酸乳桿菌LA85溶液30 d后，小鼠免疫器官指數(shù)均呈現(xiàn)升高趨勢，表明嗜酸乳桿菌LA85可以增強小鼠的免疫功能。

2.3嗜酸乳桿菌LA85對小鼠淋巴細胞增殖的影響

淋巴細胞中含有T淋巴細胞和B淋巴細胞，它們是免疫系統(tǒng)機構(gòu)和功能的核心，既負責(zé)介導(dǎo)機體的細胞免疫應(yīng)答，又能夠調(diào)節(jié)機體其他免疫細胞的功能[18]，是機體細胞免疫的直接反饋[19]。在免疫應(yīng)答過程中，T淋巴細胞的激活、分化和增殖具有重要的作用。淋巴細胞增殖實驗是檢測T細胞免疫功能的方法，因此其增殖率可直接反映細胞免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)。SRBC可刺激T淋巴細胞增殖成致敏性淋巴細胞，因此實驗中常采用SRBC反復(fù)刺激足跖，觀察其炎性腫脹程度，從而反映小鼠淋巴細胞的增殖情況。如圖1所示，與對照組比較，實驗組小鼠的足跖腫脹明顯，且有顯著差異（P<0.05），足跖腫脹度分別增加了131.75%、198.46%、257.70%。結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌可以促進脾淋巴細胞增殖，提高小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，具有體內(nèi)免疫活性。

2.4嗜酸乳桿菌LA85對小鼠血清溶血素的影響

B細胞在進行體液免疫代謝過程中通常起著重要作用，其可以通過對抗體的識別和抗原的分泌，從而實現(xiàn)體液免疫[20]。因此，通過對血清出抗體分泌量的檢測，從而反應(yīng)機體的體液免疫能力[16]。如圖2所示，與對照組比較，各劑量組中小鼠半數(shù)溶血值均有不同程度的增加，增長比例分別是12.69%、15.99%、21.48%，均存在顯著性差異（P<0.05）。結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌LA85可以促進小鼠體內(nèi)溶血素值的增加，即提高小鼠的體液免疫。

2.5嗜酸乳桿菌LA85對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響

巨噬細胞是機體發(fā)揮非特異性免疫反應(yīng)的主要免疫細胞，參與機體免疫系統(tǒng)的第一道防線，因此，小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的重要標(biāo)志之一[20]。巨噬細胞是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個重要系統(tǒng)[21]。如表3所示，與對照組比較，各劑量組中小鼠巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)得到顯著（P<0.05）提升。其中，中劑量組和高劑量組吞噬百分率相近。而吞噬指數(shù)則呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，即隨著劑量的增加，吞噬指數(shù)呈現(xiàn)顯著增加的趨勢。結(jié)果表明，一定劑量的嗜酸乳桿菌LA85一定程度上可以提升小鼠的吞噬能力。

2.6嗜酸乳桿菌LA85對小鼠NK細胞活性的影響

NK細胞是淋巴細胞細胞毒性的主要代表細胞群，在抗腫瘤和抗病毒免疫過程中起重要的作用[19]。NK細胞（自然殺傷細胞）能夠直接殺傷靶細胞，而不依賴抗體和補體，從而直接實現(xiàn)免疫抑制功能。活化的NK細胞可直接分泌和合成多種細胞免疫因子，具有直接調(diào)節(jié)免疫的重要作用。因此，NK細胞活性通常被作為衡量機體免疫能力的重要指標(biāo)之一。如圖3所示，與對照組相比，各劑量組中小鼠的NK細胞活性均得到顯著提高（P<0.05），其NK細胞活性分別增長25.50%、36.11%、41.26%。結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌LA85能夠通過提高健康小鼠的NK細胞活性從而增強機體免疫力。

3結(jié)論

益生乳酸桿菌在宿主體內(nèi)通過對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，傳遞信號給免疫細胞，對宿主免疫反應(yīng)進行調(diào)節(jié)[22-23]。有研究表明，益生乳酸菌可通過刺激腸道局部產(chǎn)生免疫抑制反應(yīng)，提高機體免疫抗體水平或巨噬細胞的活性，從而有效增強機體的免疫抑制功能。但具體調(diào)節(jié)機制尚不清楚，并且這種調(diào)節(jié)作用可能與菌種相關(guān)，具有一定的菌株特異性[24]。本文的研究結(jié)果驗證了嗜酸乳桿菌LA85具有細菌低毒性，能夠作用于小鼠免疫器官，可能通過增強小鼠細胞免疫、體液免疫，改善小鼠巨噬細胞以及NK細胞活性等途徑從而增強小鼠機體免疫機能，但是具體的免疫作用機制有待進一步研究。本文的研究可為嗜酸乳桿菌LA85改善機體免疫作用提供理論依據(jù)?！?/p>

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Research on The Effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on Immune Function of Mice

ZHAO Lin，F(xiàn)AN Ya-chen，HUANG Zi-zheng，XUE Feng，ZHANG Sen

（Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract：Objective To study the effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on immune function of mice.Method The mice were treated with Lactobacillus acidophilus LA85 by oral administration.Totally 160 mice were divided into low，media，high dose groups.The effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on immune function was evaluated by analyzing the mouse body weight index，spleen index，thymus index，cellular immunity，humoral immunity，monocyte-phagocytic cell activity and NK cell activity.Result Compared with control，thymus index increased significantly in all groups.The increase in spleen index was only observed in high dose group.The lymphocyte proliferation，HC50，phagocytosis of macrophages，NK cell activity of all the low，media，high groups were promoted significantly.Lactobacillus acidophilus LA85 had no effect on the body weight index of mice.Conclusion Treating with Lactobacillus acidophilus LA85 by oral administration can enhance cellular immunity，humoral immunity and NK cell activity of mice.

Keywords：Lactobacillus acidophilus LA85;immune function;mice