手性氣相色譜法測定野菊花中的龍腦對映體
——推薦一個儀器分析實驗

李會香，劉莎莎，雷杰

復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200433

正如左右手的鏡像關(guān)系一樣，不對稱分子和它的鏡像不能重疊的這種性質(zhì)稱為手性[1]。手性分離一直是有機(jī)化學(xué)家所關(guān)注的課題，尤其是在不對稱合成和天然產(chǎn)物分離領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。目前關(guān)于手性分離的教學(xué)論文，大都是從有機(jī)化學(xué)實驗的角度進(jìn)行介紹，重點應(yīng)用于不對稱合成領(lǐng)域，比如手性Co(III)絡(luò)合物的不對稱自催化合成和表征[3]，手性Salen-Co(II)絡(luò)合物催化芳香酮的不對稱還原反應(yīng)[4]，手性有機(jī)小分子催化劑6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-a]咪唑的合成[5]，手性高烯丙基胺的合成及表征[6]，N-叔丁烷亞磺?；鶃啺返姆菍τ尺x擇性烯丙基化[7]等，以上論文大部分采用的是液相色譜法。謝天堯等[8]推薦過適用于高年級本科生的儀器分析研究式開放性教學(xué)實驗“毛細(xì)管電泳/非接觸式電導(dǎo)法分離檢測藥片中的氧氟沙星對映體含量”。

本論文從儀器分析實驗的角度，介紹了手性氣相色譜法測定野菊花中的龍腦對映體，側(cè)重點在于手性色譜柱的原理及分離機(jī)理介紹，及將手性色譜應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離分析。

1 實驗?zāi)康?/h2>

熟悉毛細(xì)管氣相色譜儀的工作原理及操作；掌握手性色譜法的基本概念及分離基本原理；掌握用手性氣相色譜法分離野菊花揮發(fā)油中左旋龍腦和右旋龍腦的方法；掌握內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法。

2 實驗原理

相互對映而不能重合的兩種化合物彼此互稱為對映異構(gòu)體，這種現(xiàn)象稱為對映異構(gòu)現(xiàn)象。對映體在藥物中占有很大的比例，已知藥物分子中約有30%–40%是手性的，經(jīng)由化學(xué)合成得到的藥物往往是對映體，不是單一的光學(xué)異構(gòu)體。許多藥物對映體不僅藥理作用不同，而且生物轉(zhuǎn)化過程亦有差異。震驚世界的沙利度胺(thalidomide)致畸事件就是由于人們對手性藥物的認(rèn)識不足造成的[9]，20世紀(jì)50年代，德國一家制藥公司開發(fā)出一種鎮(zhèn)靜催眠藥反應(yīng)停(沙利度胺)，對于消除孕婦妊娠反應(yīng)效果很好，但很快發(fā)現(xiàn)許多孕婦服用后，生出了無頭或缺腿的先天畸形兒。雖然各國當(dāng)即停止了銷售，但卻造成6000多名“海豹兒”出生的災(zāi)難性后果。后來經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)停是包含一對對映異構(gòu)體的消旋藥物，它的一種構(gòu)型R-(+)對映體有鎮(zhèn)靜作用，另一種構(gòu)型S-(?)對映體才是真正的罪魁禍?zhǔn)住獙ε咛ビ泻軓?qiáng)的致畸作用。為了避免這類悲劇的再次發(fā)生，世界各國由此開始關(guān)注手性藥物。

利用氣相色譜分離手性化合物的研究始于20世紀(jì)50年代末期，但真正實現(xiàn)首次成功分離是在1966年，Gil-Av等報道了氨基酸對映異構(gòu)體的分離，手性固定相是將N-三氟乙?；?L-異亮氨酸月桂醇酯涂覆于毛細(xì)管內(nèi)壁上[10]。1967年Gil-Av等又用填充柱氣相色譜實現(xiàn)了氨基酸的半制備分離。盡管氣相色譜較早地應(yīng)用于手性分離，但其在隨后的年代里發(fā)展較慢，主要是該類固定相熱不穩(wěn)定性的原因。形成包合物的手性固定相最常用的是環(huán)糊精類化合物，1961年Sand等首次把環(huán)糊精(CD)用于氣相色譜分離脂肪族化合物，由于它未衍生化，天然的環(huán)糊精熔點高達(dá)290 °C，因此其在氣相色譜上的應(yīng)用一度被冷落[11]。環(huán)糊精是多個D-吡喃葡萄糖單元通過1,4-糖甙鍵連接成的環(huán)狀寡糖，六聚、七聚、八聚、九聚的分別稱為α-、β-、γ-、δ-CD。CD分子呈中空的圓筒形，筒內(nèi)呈疏水性，筒外呈親水性。CD分子的羥基在不同的反應(yīng)條件下反應(yīng)活性不同，據(jù)此可對CD分子進(jìn)行多種衍生化，引進(jìn)不同性質(zhì)的基團(tuán)。對環(huán)糊精進(jìn)行衍生化，起初人們只是為了降低環(huán)糊精的熔點和疏水性，僅是對環(huán)糊精的羥基簡單地?zé)N基化得到不同的疏水性衍生物，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到有目的地引入有特殊作用的基團(tuán)[12,13]。

手性氣相色譜法一般可以分為三種[1]，第一種為手性衍生化法，即采用手性衍生化試劑柱前衍生化，將對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為非對映異構(gòu)體后再用色譜分離非對映異構(gòu)體衍生物；第二種為手性流動相法，即在流動相中添加手性添加劑，用一般色譜柱即可分離外消旋體；第三種為手性固定相法，現(xiàn)使用的手性固定相主要有：氫鍵型手性固定相、金屬鰲合手性固定相、形成包合物的手性固定相、離子液體手性固定相、多糖類手性固定相、環(huán)肽類手性固定相和刷型手性固定相等。色譜手性分離的關(guān)鍵是手性固定相的選擇。氣相色譜手性固定相的發(fā)展過程經(jīng)歷了由作用力簡單、單一手性中心的氫鍵型手性固定相向具有多種作用力和多手性中心的復(fù)雜型手性固定相的發(fā)展過程。

天然的龍腦主要有左旋龍腦和右旋龍腦，是外消旋體。左旋龍腦在藥典上也被稱為“艾片”，主要由菊科植物艾納香莖葉經(jīng)水蒸氣蒸餾提取并重結(jié)晶而得，為白色半明片狀、塊狀或顆粒狀結(jié)晶。右旋龍腦是天然冰片的主要成分，由樟的新鮮枝葉經(jīng)提取加工而得，為白色結(jié)晶性粉末或片狀結(jié)晶[14]。冰片有清涼氣味，具有開竅醒神，清熱止痛的功效，其藥理作用有發(fā)汗、興奮、鎮(zhèn)痛及抗缺氧作用，是人丹、冰硼散、蘇冰滴丸、速效救心丸等許多中成藥的主要成分，也用于化妝品和配制香精等。本實驗中用手性氣相色譜法測定野菊花揮發(fā)油中的對映異構(gòu)體左旋龍腦和右旋龍腦的含量。

3 實驗部分

3.1 實驗試劑

野菊花樣品(安徽產(chǎn)，上海市民大藥房)，(+)-龍腦(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，98%)，(?)-龍腦(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，> 95%)，(+)-樟腦(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，> 98%)，(?)-樟腦(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，> 98%)，異龍腦(阿達(dá)瑪斯試劑有限公司，> 90%)，十一烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，> 98%)，乙酸乙酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)，無水硫酸鈉(上海大合化學(xué)品有限公司，分析純)，去離子水。

3.2 實驗儀器

氣相色譜儀(A90，常州磐諾儀器有限公司，配置氫火焰離子檢測器)；Varian CP-Chirasil-Dex CB手性毛細(xì)管柱(25 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，可調(diào)功率微波化學(xué)反應(yīng)器，水蒸氣蒸餾同時溶劑萃取裝置，電子天平，10 μL微量進(jìn)樣器，50 mL、10 mL、5 mL容量瓶，1 mL移液管，洗耳球，10 mL、250 mL量筒，50 mL磨口試劑瓶，500 mL圓底燒瓶。

3.3 實驗步驟

3.3.1 野菊花揮發(fā)油的提取

準(zhǔn)確稱取20.00 g野菊花樣品，加入到揮發(fā)油提取裝置的圓底燒瓶里，然后加入200.0 mL水，提取器中加入10.0 mL乙酸乙酯，200 W功率下，微波加熱回流提取1 h，將揮發(fā)油收集至提取器內(nèi)的有機(jī)溶劑中。待溶液冷卻后，將提取器內(nèi)的有機(jī)相轉(zhuǎn)移至50 mL磨口試劑瓶中，加入無水硫酸鈉干燥，得到澄清透明的揮發(fā)油溶液。

3.3.2 毛細(xì)管氣相色譜儀的調(diào)試和操作

氣相色譜儀的參數(shù)及升溫程序經(jīng)優(yōu)化后如下，進(jìn)樣口溫度：250 °C，檢測器溫度250 °C，載氣：高純氮氣；流速：1 mL·min?1；分流比：20 : 1。程序升溫：從60 °C開始，保持1 min；再以20 °C·min?1的升溫速度到達(dá)120 °C，保持8 min，最后再以20 °C·min?1的升溫速度到達(dá)200 °C，保持10 min。

3.3.3 (+)-龍腦和(?)-龍腦標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取(+)-龍腦和(?)-龍腦25.0 mg，用乙酸乙酯溶解，并定容至50 mL容量瓶，得到0.50 mg·mL?1(+)-龍腦和(?)-龍腦的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。稱取200.0 mg十一烷于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，得到濃度為20.0 mg·mL?1的內(nèi)標(biāo)溶液。用1 mL移液管移取配好的(+)-龍腦和(?)-龍腦的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL分別于6個5 mL容量瓶中，將10.0 μL內(nèi)標(biāo)溶液分別加入到上述6個溶液，再用乙酸乙酯定容，得到系列濃度的龍腦異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液。用微量進(jìn)樣器取1.0 μL龍腦異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液，即可通過氣相色譜儀進(jìn)樣分析。

3.3.4 野菊花中龍腦異構(gòu)體含量的測定

移取1.00 mL干燥的揮發(fā)油于5 mL容量瓶，加入10.0 μL內(nèi)標(biāo)溶液，用乙酸乙酯定容，每次取1.0 μL進(jìn)行氣相色譜分析。重復(fù)三次進(jìn)樣后，得到峰面積比的平均值，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析野菊花中(+)-龍腦和(?)-龍腦的含量。

4 結(jié)果與討論

4.1 優(yōu)化升溫程序

用0.03 mg·mL?1的龍腦異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行升溫程序優(yōu)化，所得色譜圖的局部放大結(jié)果見圖1，具體實驗數(shù)據(jù)見表1。從圖1和表1可見，在所選4個溫度下，龍腦的兩個異構(gòu)體均實現(xiàn)了基線分離，隨著溫度升高，兩個異構(gòu)體的保留時間逐漸縮短，兩者的峰面積幾乎保持不變，但是峰高呈增加趨勢，半峰寬逐漸變小，分離度也逐漸變小?？梢?，升高柱箱溫度，有利于縮短分離時間。

表1 龍腦異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液程序升溫優(yōu)化結(jié)果

圖1 龍腦異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

對野菊花揮發(fā)油樣品采用了同樣的升溫程序優(yōu)化(圖2)，從圖2可見，只有在120 °C時，龍腦的兩個異構(gòu)體才能實現(xiàn)基線分離，溫度升高時，會出現(xiàn)其他化合物和龍腦的兩個異構(gòu)體的峰重疊，這是由于野菊花揮發(fā)油的成分比較復(fù)雜(圖3)。所以最終選用了龍腦異構(gòu)體出峰時溫度為120 °C的升溫程序分離龍腦異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和野菊花揮發(fā)油中的龍腦異構(gòu)體(圖3)。

圖2 野菊花揮發(fā)油的局部放大色譜圖

圖3 最佳升溫程序下野菊花揮發(fā)油的色譜圖

4.2 龍腦異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

記錄不同濃度龍腦異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(圖4)，確認(rèn)色譜圖中龍腦異構(gòu)體的峰的保留時間，并分別計算龍腦異構(gòu)體以及內(nèi)標(biāo)的峰面積。求算龍腦異構(gòu)體/內(nèi)標(biāo)的峰面積比，用峰面積比對濃度進(jìn)行線性回歸，得到龍腦異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，結(jié)果如圖5所示。

圖4 不同濃度龍腦異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

圖5 不同濃度龍腦異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.3 實驗拓展

樟腦和異龍腦也是野菊花中常見的手性物質(zhì)，因此將樟腦、異龍腦和龍腦混合溶液進(jìn)行手性氣相色譜分析(圖6)。由圖6可見，異龍腦和龍腦的手性異構(gòu)體可以實現(xiàn)基線分離，但樟腦的異構(gòu)體無法進(jìn)行手性分離。如果需要對樟腦異構(gòu)體進(jìn)行手性分離，則需要尋找其他的手性色譜柱。本實驗所用Varian CP-Chirasil-Dex CB手性色譜柱的固定相為β-環(huán)糊精直接鍵合于二甲基聚硅氧烷上。根據(jù)文獻(xiàn)報道[15]，Astec CHIRALDEX B-DM手性色譜柱可以用于分離樟腦的異構(gòu)體，該色譜柱所用固定相為全甲基化β環(huán)糊精。因為在環(huán)糊精衍生物中，取代基的位置和類型都會直接影響到其手性選擇性，因此可以引導(dǎo)學(xué)生從分子間相互作用力的角度討論手性分離的機(jī)理，以及手性固定相的選擇策略等[16]。

圖6 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖

5 數(shù)據(jù)處理

5.1 記錄色譜操作條件

包括：儀器型號、進(jìn)樣口溫度、分流比、柱類型、柱長、載氣類型、載氣流速、檢測器類型等。

5.2 龍腦異構(gòu)體的定性分析

分別進(jìn)樣(+)-龍腦和(?)-龍腦，記錄色譜圖，讀取調(diào)整保留時間(將溶劑乙酸乙酯的保留時間作為死時間)。

5.3 龍腦異構(gòu)體的定量分析

根據(jù)龍腦異構(gòu)體的線性回歸方程，將野菊花樣品龍腦異構(gòu)體與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入，可以得到野菊花中(?)-龍腦和(+)-龍腦的含量分別為0.0837 mg·g?1和0.0731 mg·g?1。加標(biāo)回收實驗結(jié)果為，(?)-龍腦平均回收率為99.5% (相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD = 2.66%，n= 6)，(+)-龍腦回收率為100.9% (RSD =20.8%，n= 6)，表明該方法的回收率好，準(zhǔn)確度高，方法可靠。

6 實驗組織

本實驗共用時6–8 h，在處理野菊花樣品期間，可以穿插學(xué)習(xí)氣相色譜儀的使用方法、配制標(biāo)準(zhǔn)曲線所用溶液等。實驗開展過程中涉及到氣相色譜儀的使用及樣品前處理技術(shù)，建議本實驗向大學(xué)二年級下學(xué)期或三年級上學(xué)期學(xué)生開設(shè)。本實驗還可作為“氣相色譜法測定野菊花中樟腦和龍腦的含量”的拓展實驗，在基礎(chǔ)實驗結(jié)束后，指導(dǎo)學(xué)生將色譜柱更換為手性色譜柱后，進(jìn)行本實驗。

7 注意事項

注意手性色譜柱的最高使用溫度；龍腦異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)溶液屬易揮發(fā)溶液，不用時需用封口膜將容量瓶密封，并保存于4 °C冰箱中。

8 結(jié)語

本實驗向?qū)W生完整地展現(xiàn)了科學(xué)研究中樣品前處理、色譜儀器條件的優(yōu)化、樣品中手性化合物的定性分析和定量分析的流程，并且涵蓋了樣品前處理技術(shù)、手性氣相色譜分析方法、內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法等多個知識點。自實驗開設(shè)以來，教學(xué)相長，教師和學(xué)生們均對手性分離產(chǎn)生了濃厚的興趣。