超高效合相色譜法測(cè)定咖啡因含量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

謝一凡，姚莉韻,,＊，嚴(yán)忠紅，蔡玉興，金玉杰，李寧

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，上海 200025

2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，藥物化學(xué)與生物信息學(xué)中心，上海 200025

咖啡因(caffeine)是從茶葉、咖啡果中提取出來的一種黃嘌呤生物堿[1]，化學(xué)名為1,3,7-三甲基黃嘌呤，屬于一類中樞神經(jīng)興奮劑，適量食用有助于提神、去疲勞，因此含有咖啡因成分的能量飲料十分暢銷。但由于咖啡因具有刺激中樞神經(jīng)的功能，長期或過量食用對(duì)人體有害且易成癮。因此對(duì)飲料中咖啡因含量快速、準(zhǔn)確的測(cè)定，有助于人們科學(xué)合理地?cái)z入相關(guān)產(chǎn)品。

用于檢測(cè)咖啡因的分析儀器有多種，目前報(bào)道的主要有紫外光譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)[2–4]等，這些方法檢測(cè)時(shí)間均較長，而且在樣品前處理中，都需要使用較多有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境和和操作人員健康不利。

超高效合相色譜法(Ultra Performance Convergence Chromatography，UPCC或UPC2)利用超臨界二氧化碳(CO2)與少量有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇等)為流動(dòng)相，通過調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑的比例及系統(tǒng)反壓，使流動(dòng)相的極性和密度發(fā)生變化，從而控制樣品的分離效果。其優(yōu)點(diǎn)是用無毒的CO2代替了有毒的揮發(fā)性有機(jī)溶劑，不僅減少廢液處理環(huán)節(jié)、節(jié)省成本，而且可降低對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員健康的危害[5,6]。目前，許多色譜技術(shù)(如GC、HPLC、LC-MS等)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究及臨床醫(yī)學(xué)測(cè)試中，而UPC2作為一種新型色譜分離技術(shù)，不僅拓展了氣相色譜、反相高效色譜技術(shù)的局限性，能完全代替正相色譜技術(shù)，而且具有快速、高效、綠色環(huán)保及分離能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[7]。將UPC2應(yīng)用于儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)，符合培養(yǎng)高素質(zhì)、綜合能力強(qiáng)的醫(yī)學(xué)人才的需求。

本實(shí)驗(yàn)選用生活中廉價(jià)易得的三種飲料，采用UPC2測(cè)定其中咖啡因的含量，同時(shí)涉及稱量、溶解、定容等多項(xiàng)分析化學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)操作，內(nèi)容貼近生活，能激發(fā)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣，適合一年級(jí)醫(yī)學(xué)生儀器分析實(shí)驗(yàn)要求。本實(shí)驗(yàn)將化學(xué)分析與儀器分析的內(nèi)容有機(jī)結(jié)合，使學(xué)生在掌握UPC2原理和操作技能的同時(shí)，能對(duì)所學(xué)知識(shí)進(jìn)行梳理和總結(jié)，利于培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新思維[8]。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

儀器：超高效合相色譜儀(ACQUITY UPC2，美國Waters公司)，XS105電子分析天平(Mettler Toledo，瑞士)，USC-302超聲波清洗儀(上海波龍電子設(shè)備有限公司)，色譜柱(ACQUITY UPC2?BEH柱3.0 × 100 mm，1.7 μm)。

試劑：咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品(上海試劑二廠，純度≥98%)，可口可樂(500 mL)，統(tǒng)一綠茶(茉莉味，低糖，500 mL)，三得利烏龍茶(無糖，500 mL)，甲醇(TEDIA，HPLC級(jí)，美國)，二氧化碳(食品級(jí)CO2，上海成功氣體工業(yè)有限公司)。

1.2 咖啡因儲(chǔ)備液和樣品溶液的配制

(1) 準(zhǔn)確稱取咖啡因?qū)φ掌芳s10.00 mg于100 mL的容量瓶中，加70 mL甲醇，超聲溶解后，再用甲醇定容、搖勻，得濃度為0.1 mg·mL?1的溶液。移取此溶液5 mL于50 mL的容量瓶中，甲醇稀釋定容、搖勻，得濃度為10 μg·mL?1的儲(chǔ)備液。

(2) 使用移液槍分別移取可樂、綠茶、烏龍茶各0.5 mL，分別置于3個(gè)10 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋定容、搖勻，即得樣品溶液供測(cè)試用。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行，每個(gè)大組6人共同完成色譜條件優(yōu)化、系統(tǒng)適應(yīng)性考查及精密度實(shí)驗(yàn)。每個(gè)大組再分為2小組，每組3人合做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定三個(gè)飲料樣品。本實(shí)驗(yàn)為3學(xué)時(shí)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

考慮到柱溫、流速、系統(tǒng)背壓等條件的變化對(duì)樣品的分離影響不大，因此本實(shí)驗(yàn)只考查流動(dòng)相組成配比對(duì)分離的影響。色譜柱：ACQUITY UPC2?BEH柱(3.0 × 100 mm,1.7 μm)；流速：1.5 mL·min?1；檢測(cè)波長：272 nm；柱溫：25 °C；系統(tǒng)背壓2000 Psi；進(jìn)樣量：1 μL；采集時(shí)間2 min。選用CO2-甲醇的流動(dòng)相配比分別為85 : 15、90 : 10、95 : 5，用烏龍茶作為樣品進(jìn)行測(cè)試，通過對(duì)咖啡因色譜峰的保留時(shí)間、峰高、對(duì)稱性、與雜質(zhì)峰溶劑峰的分離度等考查，確定最佳流動(dòng)相的配比。

從UPC2色譜圖上可知(圖1)，CO2-甲醇的配比為90 : 10時(shí)，咖啡因色譜峰保留時(shí)間約為0.82 min(其中0.39 min為溶劑峰)，保留時(shí)間合適、峰型對(duì)稱，理論塔板數(shù)高，溶劑甲醇對(duì)樣品測(cè)定無干擾，因此，90 : 10為最佳流動(dòng)相配比。

圖1 流動(dòng)相配比對(duì)咖啡因分離效果的影響

在此優(yōu)化的流動(dòng)相配比下(90 : 10)，分別注入純甲醇、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液，根據(jù)所得色譜圖，可以發(fā)現(xiàn)三種飲料的溶劑峰、雜質(zhì)峰和咖啡因主峰完全分開，不干擾測(cè)試，符合定量分析的要求(圖2)。

圖2 溶劑、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品及飲料色譜圖

2.2 精密度和檢測(cè)波長

在優(yōu)化色譜條件下，取濃度為10 μg·mL?1的咖啡因溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算5次的色譜峰保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)平均偏差值(RSD)，用于考查儀器的精密度。結(jié)果顯示，保留時(shí)間的RSD為0.086%，峰面積的RSD為0.75%，表明儀器精密度達(dá)到測(cè)試要求(圖3)。

圖3 重復(fù)進(jìn)樣5次的咖啡因色譜疊加圖

通過PDA檢測(cè)器掃描后，從色譜圖上提取咖啡因的紫外光譜圖，得最大吸收波長為272 nm (圖4)。

圖4 咖啡因的紫外光譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的測(cè)定

將咖啡因儲(chǔ)備液稀釋為近似濃度0.5、1、5、8、10 μg·mL?1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)際濃度見表1)。在優(yōu)化色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，以濃度X與對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積Y進(jìn)行線性擬合得回歸方程。結(jié)果顯示，在0.5–10 μg·mL?1濃度范圍內(nèi)，咖啡因濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積值之間的線性關(guān)系良好(圖5)。應(yīng)用Excel軟件獲得回歸方程：Y= 1627.1X+ 189.47，R2= 1。

圖5 咖啡因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 三種飲料中咖啡因濃度測(cè)定的結(jié)果*

根據(jù)三種樣品溶液分別進(jìn)樣后獲得的色譜圖，將色譜峰峰面積代入回歸方程，即可計(jì)算溶液中的咖啡因含量，再通過換算即可得出飲料中咖啡因的含量。

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及教學(xué)效果

3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理念

由于UPC2作為大型精密分析儀器，價(jià)格較昂貴，實(shí)驗(yàn)室只有1臺(tái)。為使所有學(xué)生能充分了解和掌握儀器工作原理和操作方法，本實(shí)驗(yàn)采用了線上線下混合式的教學(xué)模式。在實(shí)驗(yàn)開始前2周，要求學(xué)生登錄化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程網(wǎng)站，觀看UPC2的虛擬仿真實(shí)驗(yàn)視頻，借助虛擬技術(shù)讓學(xué)生模擬儀器操作，增加對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的感性認(rèn)識(shí)。教師同時(shí)在線發(fā)布預(yù)習(xí)思考題：(1) UPC2的原理及特點(diǎn)；(2) 從儀器部件、被分析樣品類型、流動(dòng)相特點(diǎn)、色譜柱差異等方面比較UPC2與LC、GC的異同點(diǎn)；(3) 何謂超臨界CO2，超臨界CO2如何形成及其理化性質(zhì)；(4) 與反相高效液相色譜相比，UPC2流動(dòng)相的組成如何影響樣品分離度、峰高及保留時(shí)間。引導(dǎo)學(xué)生充分利用網(wǎng)絡(luò)資源，查閱文獻(xiàn)完成相關(guān)知識(shí)點(diǎn)的學(xué)習(xí)，既培養(yǎng)了學(xué)生自學(xué)能力，又提高了學(xué)習(xí)積極性。

3.2 教學(xué)效果評(píng)價(jià)

教學(xué)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)樣品處理簡單、快速，實(shí)驗(yàn)操作安全、環(huán)保，數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，儀器可操作性強(qiáng)，并能與儀器分析理論知識(shí)緊密結(jié)合。同時(shí)通過線上線下混合式教學(xué)模式，學(xué)生事先對(duì)儀器結(jié)構(gòu)及操作方法了解充分，使其能在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)課時(shí)內(nèi)，順利完成所有測(cè)試工作，并獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)要求每個(gè)學(xué)生單獨(dú)完成一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告，報(bào)告中除了基本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容外，還有預(yù)習(xí)思考題的回答、實(shí)驗(yàn)過程的討論等，可以提高學(xué)生分析、歸納、解決問題的能力。我們針對(duì)參與實(shí)驗(yàn)的三屆學(xué)生(預(yù)防專業(yè))共90人發(fā)放問卷調(diào)查，結(jié)果顯示，對(duì)實(shí)驗(yàn)效果的總體滿意率達(dá)92% (圖6)。

圖6 問卷調(diào)查結(jié)果

4 結(jié)語

以往HPLC、GC等分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)，由于這些大型精密分析儀器價(jià)格昂貴而數(shù)量少，受實(shí)驗(yàn)時(shí)間所局限，實(shí)驗(yàn)時(shí)往往由教師開機(jī)后完成實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置、儀器平衡等操作，而學(xué)生只能做最后進(jìn)樣的簡單操作來獲取數(shù)據(jù)，限制了學(xué)生對(duì)儀器本身了解的機(jī)會(huì)，也限制了學(xué)生的好奇心和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。

相比較而言，使用UPC2測(cè)定時(shí)，由于平衡時(shí)間短、出峰時(shí)間快，1.5 min即能完成一次樣品測(cè)試，所以在教師指導(dǎo)下學(xué)生可以參與儀器操作的全過程，使學(xué)生真正體會(huì)到儀器分析實(shí)驗(yàn)的樂趣[9–13]。本實(shí)驗(yàn)操作涉及色譜圖的疊加比較、紫外光譜圖提取及3D圖的觀察，并運(yùn)用Excel軟件獲取回歸方程及精密度的計(jì)算等，這些知識(shí)的學(xué)習(xí)能為學(xué)生今后撰寫論文和制作圖文并茂的PPT打下基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)首次采用超高效合相色譜作為分析手段，具有操作簡單、快速高效、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。由于UPC2具有綠色環(huán)保的特點(diǎn)，教學(xué)中我們還將“青山綠水就是金山銀山”的環(huán)保理念貫穿于其中，使思政教育和教學(xué)過程有機(jī)結(jié)合。