四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)CARM1在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)

張 倩，陳濤琳，余 靂，黃明敏，譚擁軍

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長沙 410082）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，按病理類型可分為浸潤性導(dǎo)管癌和非浸潤性導(dǎo)管癌。乳腺癌患者的治療成功率較低，腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險高，因而其預(yù)后較差，導(dǎo)致的死亡率也高。許多蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）的表達(dá)水平和酶活性都在乳腺癌的發(fā)病過程中起著重要作用，調(diào)控著許多與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的細(xì)胞通路。

共激活因子相關(guān)的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（coactivator associated arginine methyltransferase 1，CARM1），又稱為蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶4（protein arginine N-methyltransferase 4，PRMT4），屬于蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族［1］。作為 I型蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，CARM1能夠催化蛋白底物上的精氨酸，形成不對稱二甲基精氨酸［2］。CARM1可以通過多種機制激活轉(zhuǎn)錄，包括組蛋白H3甲基化［3］、輔助活化因子CBP/P300的甲基化［4］、染色質(zhì)重構(gòu)蛋白的招募［5］等，是哺乳動物體內(nèi)不可或缺的一種酶［6］。已有研究顯示，CARM1在結(jié)直腸癌［7］、肺癌［8］、乳腺癌［9］等多種癌癥中異常表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)［10］。近年來，CARM1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用被廣泛研究。Morettin等［9］發(fā)現(xiàn)CARM1可以被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）磷酸化，作為雌激素受體α（estrogen receptor alpha，ERα）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的共激活因子。此外，Peng等［11］發(fā)現(xiàn)CARM1可與ER結(jié)合到染色質(zhì)增強子區(qū)域，通過對底物蛋白高度甲基化來調(diào)控ER靶基因的轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和腫瘤發(fā)生。但CARM1在不同分型乳腺癌進(jìn)展中的分子機制還尚未完全闡明。

四環(huán)素表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)由Gossen等［12-13］建立，由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、四環(huán)素反應(yīng)性啟動子和四環(huán)素類抗生素三部分組成，包括tet-on基因調(diào)控系統(tǒng)和tetoff基因調(diào)控系統(tǒng)，具有高倍數(shù)誘導(dǎo)基因、可調(diào)控基因“開/關(guān)”等特點，是目前研究較多的基因表達(dá)系統(tǒng)之一。已有報道表明，經(jīng)過不斷改進(jìn)，四環(huán)素表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的應(yīng)用已不僅僅局限于癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因動物，還可以應(yīng)用于原代細(xì)胞，其應(yīng)用范圍變得更加廣闊［14］。同時，該系統(tǒng)也為基因的表達(dá)與調(diào)控、基因的生物學(xué)作用研究提供了有效的研究方法。

本研究通過四環(huán)素操縱子系統(tǒng)構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)CARM1的乳腺癌細(xì)胞株，為探索CARM1在乳腺癌中的生物學(xué)功能以及在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞儲存于湖南大學(xué)生物學(xué)院分子腫瘤學(xué)實驗室；感受態(tài)DH5α、金牌Mix酶購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；慢病毒載體pVSVG、Δ8.91均來自于上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司；pLVX-TetOne-Puro載體購自優(yōu)寶生物科技有限公司；AgeI、EcoRI限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo Scientific公司；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）以及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自GIBCO公司；嘌呤霉素（puromycin）、多西環(huán)素（doxycycline，DOX）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；β-actin、CARM1抗體購自Cell Signaling Technology公司；BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細(xì)胞與HEK293T細(xì)胞所用的培養(yǎng)基均為含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37℃、5% CO2濃度、90%相對濕度。當(dāng)HEK293T細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染；當(dāng)MDA-MB-231細(xì)胞密度達(dá)到70%進(jìn)行慢病毒感染后獲得可由DOX誘導(dǎo)CARM1過表達(dá)的MDAMB-231細(xì)胞株（即231-pCARM1細(xì)胞）。在后續(xù)試驗中，用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組（即CARM1正常表達(dá)細(xì)胞），用含1 μg/mL DOX、10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞為試驗組（即CARM1過表達(dá)細(xì)胞）。

1.2.2 pLVX -TetOne-CARM1-Puro慢病毒載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pcDNA3.1-CARM1為模板，使用5′引物（CCGGACCGGTATGGCAGCGGCGGCGGCGGC）和3′引物（CCGGGAATTCCTAGCTCCCGTAGTGCATGGT）通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及膠回收，得到CARM1片段，再使用AgeI、EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切CARM1片段，放置于37℃水浴鍋反應(yīng)1 h，金屬加熱器85℃ 15 min使酶失活，4℃保存。載體使用AgeI、EcoRI限制性內(nèi)切酶于37℃反應(yīng)1 h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及膠回收，得到酶切后pLVX-TetOne-Puro載體。將酶切后純化回收的載體和CARM1片段于22℃水浴鍋中過夜連接，反應(yīng)體系為1 μL pLVX-TetOne-Puro、4 μLCARM1片斷、1 μL T4 DNA連接酶、2 μL T4 ligase buffer、12 μL ddH2O。取5 μL連接產(chǎn)物加入到50 μL DH5α感受態(tài)大腸桿菌中，置于冰上放置30 min，42℃熱激45 s，加入300 μL LB培養(yǎng)基，放入搖床，37℃、220 r/min活化細(xì)菌1 h，用移液槍吸取適量菌液進(jìn)行涂板（含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)板），在37℃的細(xì)菌培養(yǎng)箱中正置30 min后倒置培養(yǎng)12～16 h。

1.2.3 pLVX-TetOne-CARM1-Puro慢病毒載體的鑒定

于LB固體培養(yǎng)板上挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，選取陽性克隆送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.4 慢病毒的包裝和感染

將pLVX-TetOne-CARM1-Puro（12 μg）與慢病毒包裝質(zhì)粒 pVSVG（6 μg）、Δ8.91（9 μg） 共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后收集慢病毒上清；1 000 r/min離心5 min，取上清，用0.45 μm的過濾頭過濾，去除細(xì)胞碎片，獲得慢病毒溶液，分裝于1.5 mL EP管中，-80℃保存。選取生長狀態(tài)良好的乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞，待密度至70%左右，將病毒與完全培養(yǎng)基按體積比為1∶1的比例混合均勻，加入培養(yǎng)皿中進(jìn)行病毒感染；48 h后更換新鮮培養(yǎng)基，同時加入嘌呤霉素（1 μg/mL）進(jìn)行篩選，持續(xù)7 d，將篩選得到的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到受四環(huán)素誘導(dǎo)過表達(dá)CARM1的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株。

1.2.5 蛋白提取與蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）

細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，蛋白酶抑制劑與細(xì)胞裂解液按體積比為1∶100的比例加入培養(yǎng)皿；輕微搖晃均勻，冰上放置20 min，收集至1.5 mL EP管中，4℃下13 000 r/min離心10 min，收集上清，即為總蛋白。二喹啉甲酸試驗法（bicinchoninic acid assay，BCA）測定蛋白濃度。每孔上樣量為40 μg總蛋白質(zhì)，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜；以含有Tween20的Tris緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline and Tween 20，TBST）配制5%的脫脂牛奶封閉液進(jìn)行封閉，室溫封閉1 h；4℃孵育一抗2 h，TBST洗5次，每次5 min；4℃孵育二抗2 h，TBST洗5次，每次5 min；顯影。

1.2.6 RNA提取與實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗3次，加入Triton裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總RNA。每個樣品取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以獲得細(xì)胞基因組cDNA。以cDNA為模板，加入DNA合成原料和引物進(jìn)行RT-PCR。分別對CARM1cDNA以及3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的cDNA（內(nèi)參）進(jìn)行擴(kuò)增，通過檢測不同反應(yīng)體系中CARM1cDNA的熒光強度與GAPDHcDNA 的熒光強度的比值以計算不同樣品中CARM1mRNA的相對含量。試驗中使用的引物對如下：

CARM1-F：GCCATCCTGCAAAACCACA；

CARM1-R：CGGCAAAAAACGACAGGATC。

GAPDH-F：CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA；

GAPDH-R：GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC。

RT-PCR所使用的程序如下。1）預(yù)熱：95℃2 min；2）變性：95℃ 15 s；3）退火：55℃ 15 s；4）延伸 ：68℃ 20 s；5）重復(fù)步驟2～4，循環(huán)40次。

1.2.7 細(xì)胞增殖檢測

待細(xì)胞密度至90%以上，加入1 mL 20 μmol/L胸腺嘧啶脫氧核苷類似物（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）溶液孵育2 h；去除培養(yǎng)基，加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min；去除多聚甲醛，加入1 mL PBS洗3 min，重復(fù)3遍；去除PBS，加入1 mL含0.3% Triton-100的PBS，孵育15 min；再加入1 mL PBS洗3 min，重復(fù)3遍；去除PBS，加入0.5 mL Click反應(yīng)液，避光孵育30 min；加入1 mL PBS洗3 min，重復(fù)3遍；加入含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidi-no-2-phenylindole，DAPI）的抗熒光淬滅封片液，室溫避光孵育15 min。置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 細(xì)胞周期檢測

待細(xì)胞長滿后，用PBS洗3遍，再用0.25%的胰酶消化，收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，4℃下1 000 r/min離心5 min；再用 PBS洗3遍，4℃下1 000 r/min離心5 min，去上清，加入500 μL 70%乙醇，吹打均勻，-20℃放置過夜；4℃下1 000 r/min離心5 min，去上清，加入適量PBS，進(jìn)行碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，PI與PBS體積比為1∶100，室溫避光孵育30 min；將細(xì)胞用300目篩網(wǎng)過濾至1.5 mL EP管內(nèi)，上機檢測，所得數(shù)據(jù)使用軟件Flowjo V10進(jìn)行分析。

1.2.9 細(xì)胞劃痕試驗

將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，確保細(xì)胞密度在60%以上；待細(xì)胞長滿后，去除培養(yǎng)基，用200 μL無菌槍頭劃3條平行的劃痕，用PBS洗2遍。對照組加入2 mL新鮮培養(yǎng)基，試驗組加入2 mL含1 μg/mL DOX的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行拍照。

1.2.10 平板克隆試驗

將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為400個左右，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞完全貼壁后更換為2 mL新鮮培養(yǎng)基，之后觀察細(xì)胞狀態(tài)，每2 d更換1次培養(yǎng)基；14 d后吸去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，每孔加入1 mL 0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，再用PBS洗5遍。

1.2.11 UALCAN在線網(wǎng)站分析

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是一個TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析網(wǎng)站，簡單易操作。點擊TCGA Analysis，輸入目的基因CARM1（PRMT4），選擇不同類型的癌癥進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 在線網(wǎng)站分析CARM1與癌癥的相關(guān)性

利用UALCAN網(wǎng)站分析了CARM1與不同類型的癌癥之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌（n=327）、肺癌（n=574）、乳腺癌（n=1 211）等癌癥中均存在CARM1表達(dá)異常（圖1）。這與之前的研究也是相一致的［7-9］，進(jìn)一步表明了CARM1與癌癥之間的強相關(guān)性。

圖1 在線網(wǎng)站分析CARM1與各種癌癥的相關(guān)性Fig. 1 Analysis of the correlation between CARM1 and various cancers via an online website

2.2 pLVX-TetOne-CARM1-Puro質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝

為了探索CARM1在癌癥中的生物學(xué)效應(yīng)，我們制備了pLVX-TetOne-CARM1-Puro慢病毒質(zhì)粒。首先，通過PCR擴(kuò)增得到CARM1片段，條帶長度預(yù)計為1 800 bp左右。從圖2a中可以看到其條帶位置正確。用AgeI、EcoRI限制性內(nèi)切酶雙酶切載體（圖2b），之后進(jìn)行連接過夜、轉(zhuǎn)化、挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定（圖2c）。質(zhì)粒圖譜如圖2d所示。選取狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞密度至70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后收取病毒上清，離心后過濾，-80℃下分裝保存。

圖2 pLVX-Tetone-CARM1-Puro質(zhì)粒構(gòu)建Fig. 2 pLVX-Tetone-CARM1-Puro plasmid construction

2.3 誘導(dǎo)過表達(dá)CARM1乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

為了驗證CARM1對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展起著什么樣的作用，本文檢驗了乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中CARM1的表達(dá)量。結(jié)果如圖3a所示，MDA-MB-231細(xì)胞中CARM1的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MCF-7細(xì)胞，因此，我們選擇MDAMB-231細(xì)胞作為細(xì)胞模型。通過病毒感染、嘌呤霉素（1 μg/mL）篩選獲得四環(huán)素誘導(dǎo)過表達(dá)CARM1乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株（圖3b）。提取蛋白和RNA進(jìn)行Western blot檢測和RT-PCR分析，結(jié)果如圖3c和3d所示。與對照組相比，試驗組CARM1的表達(dá)量在蛋白水平和RNA水平都有明顯上升，說明誘導(dǎo)過表達(dá)CARM1的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖3 誘導(dǎo)表達(dá)CARM1乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的驗證Fig. 3 Verification of induced expression of CARM1 in MDA-MB-231 cell

2.4 CARM1對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的生物學(xué)作用

在細(xì)胞鋪滿整個培養(yǎng)皿時進(jìn)行細(xì)胞劃痕試驗，在0、24 h拍照記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與未誘導(dǎo)的細(xì)胞相比較（圖4a1、4a2），加入DOX誘導(dǎo)24 h后的231-pCARM1細(xì)胞（圖4a3、4a4）遷移能力更強；使用結(jié)晶紫染色來觀察細(xì)胞克隆形成，發(fā)現(xiàn)與未誘導(dǎo)的細(xì)胞相比較，加入DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆形成能力更強（圖4b）；使用EdU-488細(xì)胞增殖試劑盒檢測細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)與未誘導(dǎo)的細(xì)胞相比較，誘導(dǎo)后的細(xì)胞增殖能力更強（圖4c）；利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，發(fā)現(xiàn)與未誘導(dǎo)的細(xì)胞相比較，誘導(dǎo)后的細(xì)胞G1期細(xì)胞比率減少，S期和G2/M期的細(xì)胞比率增加，過表達(dá)CARM1能夠促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程（圖4d）。這些結(jié)果表明，誘導(dǎo)過表達(dá)CARM1對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移有一定的促進(jìn)作用。

圖4 過表達(dá)CARM1促進(jìn)了乳腺癌的遷移、克隆形成以及增殖Fig. 4 Overexpression of CARM1 promotes migration, clonal formation and proliferation of breast cancer

3 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的疾病，70%～80%未發(fā)生轉(zhuǎn)移的早期乳腺癌患者能夠得到治愈，而臨床上對于絕大多數(shù)已發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期乳腺癌患者則缺乏有效的治療手段［15］。2018全球癌癥報告顯示，乳腺癌在全球女性癌癥中的發(fā)病率和死亡率位居首位，且發(fā)病率仍在上升［16］。

PRMTs涉及許多細(xì)胞過程，包括轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、RNA代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等［17］。CARM1催化精氨酸的甲基化修飾是一種翻譯后修飾，不論是在正常生理過程還是疾病中都發(fā)揮著不可忽視的作用。Shishkova等［6］發(fā)現(xiàn)了130多個CARM1的甲基化底物蛋白，且大多與癌癥相關(guān)。例如，中介體復(fù)合物亞基12（mediator complex subunit 12，MED12）在人類各種癌癥中頻繁發(fā)生突變，與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)，而CARM1可甲基化MED12，并與其表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性，二者高表達(dá)能夠顯著提高乳腺癌患者的總生存率和無病生存率［18］。另有研究證實，CARM1也可以甲基化組蛋白H3第17位的精氨酸，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子E2F1（E2F transcription factor 1，E2F1）的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長與增殖［19］。與此一致的是CARM1過表達(dá)增加了細(xì)胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）的表達(dá)水平，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生［20］。這些證據(jù)表明，CARM1的表達(dá)水平過高能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

以上試驗結(jié)果表明，CARM1在乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移等過程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用，并可能借此參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。然而，細(xì)胞水平的研究可能無法準(zhǔn)確反映在人體內(nèi)CARM1與乳腺癌之間的聯(lián)系。因此，在后續(xù)的研究過程中，本課題組將在個體水平上更深入地研究CARM1與乳腺癌發(fā)病機制之間的聯(lián)系，以期為乳腺癌的臨床干預(yù)提供新的治療靶點。