基于生物信息學分析宮頸癌中TGFBI的表達及臨床意義

許明娜，郭亞茹，楊 松，王玉茹，劉桂紅，辛 勇

（徐州醫(yī)科大學 a. 研究生學院；b. 附屬醫(yī)院腫瘤放射治療科，徐州 221002）

宮頸癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）是人類目前第四大常見癌癥。據(jù)估計，2018年全世界共有57萬例CESC患者，其中31.1萬例患者因CESC死亡［1］。宮頸癌成為繼乳腺癌后20～39歲婦女癌癥相關死亡的第二大原因［2］。宮頸癌癌前病變和癌性病變的主要原因是感染高危型或致癌型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）。HPV16和HPV18感染是引起CESC的主要原因［3］。高危型尤其是HPV16，在人類中非常普遍。盡管近幾十年來在腫瘤治療和臨床診斷方面取得了一些進展，但復發(fā)或晚期CESC患者的臨床結果和長期生存仍然令人沮喪。因此，探究CESC進展的分子對于改善CESC的治療有很大的臨床價值。轉化生長因子β誘導基因（transforming growth factor-β induced gene，TGFBI）位于5號染色體5q31.1條帶，編碼的蛋白質分子量為74 681 Da，由683個氨基酸組成［4］。TGFBI在細胞內(nèi)被翻譯成蛋白質后分泌至細胞外基質。因此，TGFBI蛋白是一種細胞外基質，在調節(jié)內(nèi)皮血管的生成方面起重要作用。有研究表明，TGFBI可能通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路來調節(jié)內(nèi)皮細胞，從而在血管生成中發(fā)揮重要作用［5］。TGFBI與整合素和其他細胞外基質相互作用，介導細胞黏附和遷移，在生理和病理條件下均發(fā)揮重要作用，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、角膜營養(yǎng)不良和腫瘤發(fā)生等［6］。目前尚無文獻報道TGFBI在CESC組織中的研究。本文擬分析TGFBI在CESC組織中的表達水平及其與患者預后關系，以期作為CESC早期新的診斷指標及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 TGFBI在CESC中和正常組織中的表達情況分析

采用Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索TGFBImRNA在CESC和正常組織中的表達情況。Oncomine數(shù)據(jù)庫（https://www.Oncomine.org）是一個大型癌癥綜合性在線數(shù)據(jù)庫［7］，主要用以挖掘癌癥基因信息。檢索條件 ：“Gene：TGFBI”“Threshold By ：P=1e-4 ；Fold Change：2 ；Gene Rank：Top 10%”“Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis”“Cancer Type：Cervical Cancer”及“Data Type：mRNA”。

運用人類蛋白質圖譜（the human protein atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫（www.proteinatlas.org） 分析TGFBI蛋白在CESC中的表達情況。 HPA是一項使用基于抗體的蛋白質組學系統(tǒng)地探索人類蛋白質組的國際計劃［8］。檢索步驟：在HPA數(shù)據(jù)庫首頁輸入基因“TGFBI”，點擊“PATHOLOGY”，可見TGFBI蛋白在CESC組織與正常宮頸組織免疫組織化學分析結果。

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析TGFBI在宮頸癌組織與癌旁組織的表達差異。GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/help.html）是由北京大學開發(fā)的一個交互式網(wǎng)絡服務器，用于整合和分析癌癥表達譜數(shù)據(jù)［9］。檢索條件：輸入基因“TGFBI”，點擊“Go-PIA”。

1.2 TGFBI表達水平對CESC患者預后的影響分析

利用 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（https://kmplot.com/analysis/）的宮頸鱗癌數(shù)據(jù)集分析TGFBI表達量與CESC患者預后的關系。利用此數(shù)據(jù)庫對來自多個數(shù)據(jù)庫的54 000個基因對21種癌癥類型生存率的影響進行了分析［10］。設定條件 ：1）Cancer：Cervical squamous cell carcinoma （n=304）；2）Gene symbol：TGFBI；3）Survival：Overall survival；4）Split patients by：median，選擇Auto select best cutoff，其余選項設為默認。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫及Oncolnc數(shù)據(jù)庫（http://www.oncolnc.org/）進一步驗證。

1.3 TGFBI在CESC中的表達情況及與病理分級之間的關系分析

采用 LinkedOmics網(wǎng)站分析TGFBI表達水平與CESC臨床病理因素的相關性。LinkedOmics網(wǎng)站（http://www.linkedomics.org/login. php）包含來自癌癥基因組圖譜計劃（the cancer genome atlas program，TCGA）項目的32種癌癥類型和共計11 158例患者的多組學數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)［11］。檢索步驟：1）選擇腫瘤類型為“CESC”；2）選擇TCGA-CESC RNAseq數(shù)據(jù)；3）輸入目的基因“TGFBI”；4）選擇數(shù)據(jù)中的聯(lián)合分析臨床數(shù)據(jù)“TCGA-CESC Clinical”；5）選擇“Non-Parametric Test”，點擊“SubmitQuery”進行分析。

1.4 TGFBI在CESC組織中啟動子甲基化表達水平分析及其與患者臨床病理因素的相關性分析

運用Ualcan數(shù)據(jù)庫分析TGFBI在CESC組織中啟動子的甲基化水平，并且分析其甲基化水平與CESC患者臨床病理因素的相關性。Ualcan數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu）是一個操作簡便的交互式門戶網(wǎng)站，可用來深入分析TCGA基因表達數(shù)據(jù)［12］。進入Ualcan數(shù)據(jù)庫，選擇TCGA Gene analysis板塊，在“Eenter gene sybol(s)”框中輸入目的基因“TGFBI”，在“TCGA dataset”選擇“cervical squamous cell carcinoma”，點擊Explore進入TGFBI分析界面后，點擊“Methylation”進行分析。

1.5 TGFBI在CESC組織中細胞免疫浸潤情況分析

采用Timer數(shù)據(jù)庫分析TGFBI在CESC組織中細胞免疫浸潤情況。Timer數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是一個系統(tǒng)分析多種癌癥與免疫細胞浸潤相關的大型綜合數(shù)據(jù)庫［13］。檢索條件：在“Gene”模塊的“Gene Symbol”輸入“TGFBI”，“Cancer Types”選擇“CESC”，其余選項設為默認。

2 結果與分析

2.1 TGFBI mRNA在宮頸癌組織的表達

Oncomine數(shù)據(jù)庫分析顯示，TGFBImRNA在CESC組織與正常宮頸組織中具有差異表達的共有4個子數(shù)據(jù)集（圖1a）：Scotto宮頸癌（圖1b）、Pyeon-Multi癌（圖1c）、Zhai宮頸癌（圖1d、圖1e）、Biewanga宮頸癌（圖1f），共236個樣本。這提示TGFBI在宮頸癌組織中呈高表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示，與正常宮頸組織（n=13）相比，TGFBImRNA在CESC（n=306）中呈高表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖1g）。

圖1 TGFBI mRNA在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達Fig. 1 Expression of TGFBI mRNA in CESC and adjacent tissues

2.2 TGFBI蛋白質在宮頸癌組織中的表達

在HPA數(shù)據(jù)庫中提取正常宮頸組織和CESC組織中TGFBI蛋白免疫組織化學圖像，進一步證實了TGFBI蛋白在CESC組織中相對正常宮頸組織表達水平明顯增加（圖2）。

圖2 TGFBI蛋白在正常宮頸組織與CESC組織中的表達水平（免疫組化染色，HPA數(shù)據(jù)庫）Fig. 2 Expression of TGFBI protein in normal cervical tissue and CESC tissue ( immunohistochemical staining , HPA database)

2.3 TGFBI表達水平與宮頸癌各臨床病理特征的關系

TGFBI表達與CESC的組織類型（P=1.248e-03）、種族（P=6.051e-1）、年齡（P=4.990e-02）、腫瘤純度（P=1.505e-02）、放療（P=8.395e-01）、T分期（P=3.656e-01）、M分期（P=8.328e-01）、N分期（P=9.348e-01）、淋巴結轉移數(shù)量（P=9.307e-01）相關。TGFBI在宮頸鱗癌中的表達高于其他類型CESC組織（圖3a）。TGFBI在西班牙裔種族患者中的表達高于其他種族（圖3b）。隨著患者年齡增大，TGFBI表達增高（圖3c）。TGFBI表達量與腫瘤純度呈負相關，腫瘤純度升高，TFGBI表達降低（圖3d）。在放療患者中TGFBI的表達量較未進行放療患者的表達較高（圖3e）。Tis分期與T4分期的TGFBI表達高于其他分期組（圖3f），N1分期的TGFBI表達高于N0分期組（圖3g），M1分期的TGFBI表達高于M0分期組（圖3h）。在6個淋巴結轉移組的TGFBI表達高于其他數(shù)量淋巴結轉移組（圖3i），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖3 TGFBI表達水平與CESC臨床病理參數(shù)的關系（LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫）Fig. 3 Relationship between TGFBI expression and clinical pathological parameters of CESC (LinkedOmics database)

2.4 TGFBI的表達與CESC患者預后的關系

通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對304個樣本進行生存預后分析，結果表明，TGFBI高表達組總體生存時間及無病生存時間更短，預后更差，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過GEPIA及Oncolnc數(shù)據(jù)庫的進一步檢驗也證實了以上結論（P<0.05）（圖4）。

圖4 TGFBI 表達水平與CESC患者預后的生存曲線Fig. 4 Relationship between TGFBI expression and prognosis of CESC patients

2.5 TGFBI在宮頸癌中甲基化情況及其與患者臨床病理特征的關系

Ualcan數(shù)據(jù)庫分析顯示，在CESC組織中TGFBI甲基化水平較宮頸正常組織降低（圖5a）（P<0.005）。隨著腫瘤期別的增高，TGFBI甲基化水平降低（圖5b）（P<0.005）。如圖5c所示，TGFBI甲基化水平在Grade 1最低，在Grade 2中高于Grade 1和Grade 3（Grade 1 vs. Grade 2，P=8.216 800e-01；Grade 1 vs. Grade 3，P=5.725 800e-01 ；Grade 2 vs.Grade 3，P=3.317 400e-01）。81～100歲組患者中TGFBI甲基化水平最低，41～60歲組患者TGFBI甲基化水平高于其他年齡段患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005）（圖5d）。TGFBI在子宮內(nèi)膜癌的甲基化水平低于其他類型的宮頸癌組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005）（圖5e）。對TGFBI甲基化水平與CESC淋巴結轉移的相關性分析顯示，TGFBI在N1的甲基化水平低于N0的宮頸癌組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005）（圖5f）。African-American中TGFBI甲基化水平低于其他種族，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005）（圖5g）。肥胖及超重人群中甲基化水平顯著低于正常體重人群，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005）（圖5h）。

圖5 TGFBI甲基化水平與CESC臨床病理特征的相關性Fig. 5 Correlation between methylation level of TGFBI and clinicopathological features of CESC

2.6 TGFBI基因與免疫細胞浸潤水平的關系

Timer數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，TGFBI基因在宮頸癌免疫微環(huán)境中與腫瘤細胞純度、B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞的表達負相關，與巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的表達正相關，P值均小于0.050，差異具有統(tǒng)計學意義（圖6）。

圖6 TGFBI表達水平與免疫細胞浸潤水平的相關性Fig. 6 Correlation between expression level of TGFBI and infiltration level of immune cells

3 討論

全球CESC死亡率高達50%，其中發(fā)展中國家死亡率超過85%［14］。雖然近年來CESC的篩查降低了其發(fā)病率和死亡率，但年輕婦女的發(fā)病率增高仍然是一個公共衛(wèi)生問題。持續(xù)感染HPV是宮頸上皮內(nèi)瘤變和浸潤性宮頸癌發(fā)生的主要原因［15］。但是CESC發(fā)病機制仍不明確，目前尋找治療靶點，探討其病理機制，對CESC患者的診斷和治療具有很大價值。

TGFBI是一種由腫瘤細胞分泌的TGF-β誘導的細胞外基質蛋白，它可以作為腫瘤啟動子或腫瘤抑制因子［16］。例如，TGFBI的旁分泌機制促進間充質干細胞刺激腫瘤生長［17］。而TGFBI缺乏癥使小鼠容易發(fā)生自發(fā)性腫瘤，TGFBI在體內(nèi)作為腫瘤抑制因子，其缺失與細胞增殖、腫瘤進展和血管生成有關［18］。TGFBI在多種腫瘤中高表達，并且促進腫瘤細胞的生長侵襲和遷移。例如，結直腸癌患者體內(nèi)TGFBI高表達，影響癌細胞和內(nèi)皮細胞之間的串擾而促進腫瘤發(fā)生和血管生成［19］。此外，TGFBI在結腸癌中的高表達是癌細胞向肝肺轉移的標志［20］，可作為結直腸癌早期診斷的生物標志物［21］。TGFBI在腎透明細胞癌中過度表達［22］，在腎透明細胞癌免疫浸潤中起著重要作用［23］，可能是一種新的預后生物標志物和免疫治療靶標。TGFBI在漿液性和子宮內(nèi)膜樣卵巢癌中的表達高于其他亞型，在Ⅲ期和Ⅳ期的表達高于Ⅰ期［24］。TGFBI作為腫瘤微環(huán)境分泌體的成分促進了卵巢癌腫瘤細胞的遷移［25］。TGFBI對間皮瘤和乳腺癌細胞的發(fā)育具有抑制作用，可能通過抑制細胞增殖、誘導衰老等途徑發(fā)揮作用［26］。在口腔鱗狀細胞癌中，TGFBI的高表達促進口腔鱗狀細胞癌的增殖并與患者預后不良相關［27］。TGFBI與胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力有關，可作為胰腺癌導管癌患者預測預后的生物標志物［28］。此外，TGFBI在膀胱癌［29］、膠質瘤［30］、胃癌［31］、食管癌［32］、黑色素瘤［33］中的表達均高于鄰近癌旁組織，并且促進腫瘤的遷移和侵襲。然而，關于TGFBI在CESC中的作用罕有報道。本研究通過多數(shù)據(jù)庫對TGFBI在CESC中的表達及其與患者的臨床病理參數(shù)的關系展開研究，為CESC的診斷和治療提供新的方向。

TGFBI在CESC組織中高表達并與臨床分期呈正相關，且不利于CESC患者的生存。TGFBI表達與CESC患者的組織類型、種族、患者年齡、腫瘤純度、放療、T分期、M分期、N分期、淋巴結轉移數(shù)量相關。通過HPA數(shù)據(jù)庫分析，進一步得出TGFBI蛋白在CESC組織中的表達高于正常宮頸組織。在CESC組織中TGFBI甲基化水平較宮頸正常組織明顯降低。TGFBI的表達與CESC腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的表達呈正相關，與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞的表達呈負相關，提示TGFBI可能通過調節(jié)CESC組織中腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞浸潤發(fā)揮作用。因此，可以推測TGFBI在CESC的發(fā)生過程中激活機體的免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生某種特定抗腫瘤免疫應答。

綜上所述，TGFBI在CESC中呈高表達的狀態(tài)，且在CESC中的高水平表達與CESC的惡性程度及患者不良預后顯著相關，TGFBI在一定程度上表現(xiàn)出促癌基因特性。因此，TGFBI將有可能成為CESC的標志物及潛在治療靶點。